氯化鋰對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖及核因子-κBp65表達(dá)的影響

李輝 張開基 李萬(wàn)成

糖原合成酶激酶－3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)不但參與肌肉能量?jī)?chǔ)存和新陳代謝，還參與多種生物學(xué)效應(yīng)，如在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、腫瘤形成等多方面發(fā)揮重要作用。GSK-3是WNT信號(hào)途徑和NF-κB信號(hào)系統(tǒng)發(fā)生交叉對(duì)話(crosstalk)的結(jié)合點(diǎn)，研究證實(shí)WNT信號(hào)途徑的異常持續(xù)激活參與了包括惡性腫瘤在內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如大腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌以及肝癌等。在WNT信號(hào)通路中GSK-3起著關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)酶作用，它通過(guò)促進(jìn)癌蛋白β-連接素(β-catenin)降解而抑制該信號(hào)通路的激活。

但有研究報(bào)道，使用GSK-3高選擇性抑制劑——鋰劑能夠誘發(fā)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，如人髓性細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL-60、人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937和人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780等[1]，這顯然與WNT信號(hào)作用相矛盾，是否GSK-3在腫瘤細(xì)胞存在有其他信號(hào)機(jī)制發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究以離體培養(yǎng)的A549人肺腺癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)不同濃度氯化鋰(LiCL)干預(yù)，觀察抑制GSK-3對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌(A549)細(xì)胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心呼吸實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；新生小牛血清購(gòu)自成都哈里生物公司；LiCL為華北制藥廠產(chǎn)品；MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SP超敏試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司；NF-κBp65抗體購(gòu)自長(zhǎng)沙三創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。主要儀器：NUAIRE超凈工作臺(tái)為蚌埠凈化設(shè)備廠產(chǎn)品，日本Olympus倒置光學(xué)顯微鏡，MS-352全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀。

1.2 方法 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞株，按1×104/孔、200μl/孔接種至96孔培養(yǎng)板后培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后加入100μl含培養(yǎng)液的不同濃度LiCl，并保證終濃度分別達(dá)到2.5mmol/L(實(shí)驗(yàn)1組)、5mmol/L(實(shí)驗(yàn)2組)、10mmol/L LiCl(實(shí)驗(yàn)3組)，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后加入MTT，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=(1-A490值/對(duì)照組A490值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(2)將A549單細(xì)胞懸液接種于有血蓋片的六孔培養(yǎng)板中，每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞完全貼壁時(shí)，棄原培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要實(shí)驗(yàn)組加入不同劑量LiCl(均使用DMEM培養(yǎng)液溶解),使實(shí)驗(yàn)1組、2組、3組終濃度分別達(dá)到2.5,5.0和10.0mmol/L,對(duì)照組加入等量DMEM培養(yǎng)基，置CO2孵箱中培養(yǎng)48h。磷酸鹽緩沖液洗滌；丙酮固定，免疫組化步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗染色。

1.3 結(jié)果判定及分析 以細(xì)胞核呈明確的棕黃色為陽(yáng)性染色，使用Nikon光學(xué)顯微鏡對(duì)切片觀察，用SPOT Cool CCD攝像頭進(jìn)行圖像采集。用Image pro plus 4.10版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析、x2檢驗(yàn)等，P＜0.05表示差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯化鋰對(duì)A549細(xì)胞MTT值的影響 藍(lán)(MTT)檢測(cè)法顯示了活細(xì)胞能量代謝，反應(yīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)。試驗(yàn)組A549細(xì)胞分別與不同濃度的氯化鋰(2.5～10.0mmol/L)培養(yǎng)48h后,結(jié)果顯示各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的MTT值顯著低于對(duì)照組，差異有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),試驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與對(duì)照組比較呈劑量依賴關(guān)系,其中試驗(yàn)3組細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到48.03%,見表1及圖1、圖2。

2.2 LiCl對(duì)NF-κBp65表達(dá)的影響 各組A549細(xì)胞均顯示出NF-κBp65蛋白表達(dá)，主要在胞漿。使用LiCl處理48h后，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組之間NF-κBp65蛋白隨LiCl濃度上升而表達(dá)下降，各實(shí)驗(yàn)組之間比較，其表達(dá)有明顯差異(P＜0.05)，見表2。

3 討論

鋰是人體非必要微量元素，近年來(lái)人們?cè)诖罅矿w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí),鋰劑可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以LiCl作用于A549肺癌細(xì)胞后，用MTT法發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞明顯凋亡增加且凋亡程度與LiCl濃度呈正相關(guān)。

表1 不同濃度氯化鋰對(duì)A549細(xì)胞毒性作用(±s)

表1 不同濃度氯化鋰對(duì)A549細(xì)胞毒性作用(±s)

注：a:與對(duì)照組比較，P＜0.01；b:與實(shí)驗(yàn)3組比較，P＜0.01)；c:與實(shí)驗(yàn)3組比較，P=0.06。

組別 MTT(mmol/L) 細(xì)胞增殖抑制率(%)對(duì)照組 2.54±0.28試驗(yàn)1組 2.10±0.30abc 17.33實(shí)驗(yàn)2組 1.75±0.23ab 31.11實(shí)驗(yàn)3組 1.32±0.20a 48.03

表2 不同濃度LiCl對(duì)A549細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響(±s)

表2 不同濃度LiCl對(duì)A549細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響(±s)

注：a: 與對(duì)照組比較，P＜0.01;b:實(shí)驗(yàn)各組間比較，P＜0.05。

組別iNOS陽(yáng)性率(%)對(duì)照組 74.2±5.11實(shí)驗(yàn)1組 62.4±2.88ab實(shí)驗(yàn)2組 53.6±3.20ab實(shí)驗(yàn)3組 34.8±3.27ab

NF-κB是屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化及凋亡有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，腫瘤細(xì)胞中存在NF-κB蛋白高表達(dá)，這也是腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)別之一[2]。Schwabe等[3]報(bào)道NF-κB系統(tǒng)在GSK-3抑制后，其活性受到抑制，并能有效增加肝細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組LiCl作用于A549細(xì)胞48h后，NF-κBp65表達(dá)均明顯下降，與對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)，各實(shí)驗(yàn)組間比較有顯著性差異(P＜0.05)；其水平隨LiCl濃度增加而降低，證明NF-κB系統(tǒng)受到抑制且與LiCl濃度相關(guān)，A549細(xì)胞產(chǎn)生的增殖抑制效果可能與此有關(guān)。使用氯化鋰抑制GSK-3后抑制腫瘤細(xì)胞增殖表明，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮作用，而WNT信號(hào)途徑作用并不明顯。

圖1 不同濃度LiCl體外作用A549細(xì)胞48h后MTT值的影響

圖2 不同濃度LiCl對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制 率的影響

[1]鐘梅,吳易元,朱巖,等.鋰誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)理初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,1998,18(1):5-11.

[2]Tsutomu S,Toyokazu M,NavRi W,et al.Nuclear factor-κB dependent exression of metastasis suppressor KAI1/cd82 gene in lung cancer cell lines expressing mutant p53[J].Cancer Res,2001,61(8):673-678.

[3]Schwabe RF,brenner DA.Role of glycogen synthase kinase-3 in TNF--induced NF-B activation and apoptosis in hepatocytes[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283(1):204-211.