豬戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)*

冉旭華,聞曉波,王 密,李冬野,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點實驗室,黑龍江大慶 163319)

豬戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)*

冉旭華,聞曉波*,王 密,李冬野,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點實驗室,黑龍江大慶 163319)

利用分子生物學(xué)軟件分析GenBank公布的豬戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,確定了其C端抗原性較高的區(qū)域,針對此區(qū)域設(shè)計并合成了一對特異性引物,RT-PCR擴增該區(qū)域,并將此片段克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)上,命名為pET30a-ORF2C,然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明,RT-PCR擴增得到301 bp的片段,重組蛋白大小約為18 ku,與預(yù)期大小相符。Western blot分析表明,該蛋白與陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),為進一步利用其建立診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

豬戊型肝炎病毒;ORF2;主要抗原表位區(qū);表達(dá)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的、經(jīng)消化道傳播的急性病毒性肝炎,其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、食欲不振、惡心、嘔吐、尿色深黃、常見黃疸,病程可持續(xù)1周,但具有自限性[1]。該病主要發(fā)生于衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家。HEV可在多種動物體內(nèi)分離到,1997年美國發(fā)現(xiàn)了豬戊型肝炎病毒,且與人HEV具有較高的同源性,隨后證實其為一種人畜共患病病原,因其具有重要的公共衛(wèi)生意義而備受重視[2]。

豬戊型肝炎病毒(Swine hepatitis E virus,SHEV)屬杯狀病毒科,為無囊膜的單股正鏈 RNA病毒,直徑 27 nm～32 nm,表面粗糙,呈不規(guī)則球形。基因組全長約為7.2 kb～7.6 kb,5′端有27 bp的非編碼區(qū),基因組編碼3個開放閱讀框架ORF1、ORF2和 ORF3[3]。ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)RNA依賴性RNA聚合酶;ORF2編碼病毒的衣殼蛋白,富含重要的抗原表位;ORF3編碼磷蛋白,可能為型特異性抗原表位,與特異性免疫反應(yīng)有關(guān)。SHEV目前尚不能進行細(xì)胞培養(yǎng),所以其診斷與檢測多使用重組抗原或合成肽抗原,相關(guān)研究多是圍繞ORF2和ORF3開展的,尤其是其結(jié)構(gòu)蛋白ORF2[4]。

本試驗從大慶地區(qū)采集的糞便病料中用特異性引物擴增得到SHEV ORF2 C端的主要抗原表位區(qū),使用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá),為利用此重組蛋白作為診斷抗原建立檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、陽性血清和載體 病料采自大慶地區(qū)的1月齡～3月齡仔豬糞便;陽性血清、pMD18-T載體、pET30a(+)載體、大腸埃希菌 TG1、BL21由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點實驗室保存供用;BL21(DE3)pLysS購自Novagen公司。

1.1.2 酶和試劑 ExTaqDNA聚合酶、BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker(DL 2 000)購自寶生物工程(大連)有限公司;鼠源反轉(zhuǎn)錄酶購自MBI Fermentas;RNA酶抑制劑、Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司;特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;HRP購自Jackson公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的SHEV DQ1株序列(DQ279091)[5]設(shè)計ORF2 C端主要抗原表位區(qū)的特異性引物,委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下(酶切位點下劃線):

Upper:5′-AAGGATCCGGCGAGCCGACTGTGAAACTT T-3′(BamH Ⅰ)

Lower:5′-GCGAAGCTTCGGTAGCCACGTTAACAAATGTCAC-3′(Hind Ⅲ)

1.2.2 病毒基因組RNA的提取 糞便用滅菌PBS制成100 mL/L懸液,10 000 r/min離心15 min取上清,置-20℃?zhèn)溆?。按照T rizol RNA提取試劑盒使用說明書提取病毒基因組RNA。

1.2.3 PCR擴增 取RNA,參照 MBI Fermentas的使用說明書進行反轉(zhuǎn)錄。取上述cDNA進行PCR擴增,反應(yīng)體系如下:10×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNT P 4 μ L,引物 1 μ L(上下游引物各0.5 μ L),cDNA 1 μ L,ExTaqDNA 聚合酶 2 U,補水至50 μ L。反應(yīng)條件為95℃變性5 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 回收上述PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TG1感受態(tài)細(xì)胞,堿裂解法提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切鑒定,篩選陽性克隆測序。目的片段酶切后連接到pET30a(+)載體上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞,陽性質(zhì)粒命名為pET30a-ORF2C。

1.2.5 重組蛋白表達(dá) 對重組菌的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化。試驗中采用最佳的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)條件進行誘導(dǎo)表達(dá)。陽性菌于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8,用終濃度 1.0 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h,而后取樣進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blot 經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(0.22 μ m)上,50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜,1∶50倍稀釋的SHEV陽性血清室溫孵育1 h,PBST洗滌。1∶500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG室溫孵育1 h,PBST洗滌,DAB顯色,進行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增

RT-PCR擴增出1條301 bp的特異性片段,與預(yù)期相符(圖1),測序結(jié)果表明為SHEV ORF2 C端序列。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

用1.0 mmol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)5 h。SDSPAGE電泳檢測,結(jié)果表明目的蛋白得到了高效表達(dá),重組蛋白分子質(zhì)量約為18 ku(圖2)。

2.3 Western blot分析

表達(dá)的重組蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,可與SHEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),顯色后出現(xiàn)單一且特異的清晰條帶(圖3)。

圖1 PCR擴增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product

圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analy sis of the expressed proteins

3 討論

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的人畜共患病,呈世界性分布,既有散發(fā)也有流行,但主要分布在衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家,在亞洲等發(fā)展中國家存在的主要是基因Ⅳ型。最近幾年從豬體內(nèi)也檢測到了戊型肝炎病毒,并證實豬戊型肝炎具有重要的公共衛(wèi)生意義。我國有關(guān)SHEV的研究才剛剛開展,流行病學(xué)調(diào)查表明,在多個省市及地區(qū)普遍存在,感染率較高,以基因Ⅳ型為主。

圖3 Western blot分析Fig.3 Western blot analy sis

SHEV病毒對體外環(huán)境敏感,抵抗力弱,且目前還沒有成熟的體外培養(yǎng)系統(tǒng),這使其診斷和疫苗的研發(fā)較為困難。目前該病毒的檢測方法主要有ELISA、RT-PCR、血清中和試驗、免疫印跡、免疫電鏡、免疫熒光等。各種方法各由利弊,ELISA法因其可用于大規(guī)模的臨床檢測而被廣泛應(yīng)用。而由于該病毒培養(yǎng)困難,所以其包被抗原主要采用合成抗原。

SHEV基因組編碼的3個ORF中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,抗原性較弱,不適合作為診斷抗原。而ORF2和ORF3編碼的蛋白具有較好的抗原活性,是研制SHEV ELISA診斷試劑的主要分子靶標(biāo)[6]。國內(nèi)外已有報道利用不同的表達(dá)系統(tǒng)(大腸埃希菌、昆蟲細(xì)胞、桿狀病毒和酵母)研究不同區(qū)域的免疫原性,用于制備SHEV診斷試劑[7]。研究結(jié)果表明,表達(dá)抗原對SHEV抗體的敏感性和特異性的次序依次為:含有ORF2和ORF3表達(dá)抗原的重組蛋白＞ORF2表達(dá)抗原＞ORF3表達(dá)抗原[8]。ORF2編碼的衣殼蛋白抗原表位數(shù)量較多,特別是其富含疏水區(qū)的C端2/3部分,存在多個能誘導(dǎo)免疫保護的免疫優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位,是人工制備SHEV診斷抗原的首選區(qū)域。

國內(nèi)學(xué)者對SHEV進行了流行病學(xué)調(diào)查,證實黑龍江省大慶地區(qū)有SHEV,且以基因Ⅳ型為主[9],并針對大慶分離的SHEV進行了抗原表位的初步探索與研究[10-11]。本研究在此國內(nèi)外研究背景下,通過使用DNA Star軟件分析已公布的SHEV大慶分離株DQ1株的ORF2氨基酸序列,針對其C端抗原性高的區(qū)域設(shè)計特異性引物,通過RT-PCR從糞便中擴增得到目的片段,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-ORF2C,經(jīng)誘導(dǎo)在大腸埃希菌中高效表達(dá)。純化后的蛋白經(jīng)Western blot鑒定具有良好的生物活性。本研究為下一步利用該重組蛋白作為診斷抗原對大慶地區(qū)SHEV進行檢測奠定了基礎(chǔ),同時為該病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的篩選提供依據(jù)。

[1]殷 震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:519-523.

[2]M eng X J,Purcell R H,Halbur P G,et al.A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(18):9860-9865.

[3]周錦萍,曾榮譽,孫泉云,等.豬戊型肝炎研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2006,27(8):52-55.

[4]Surjit M,Jameel S,Lal S K.Cy toplasmic localization of the O RF2 protein of hepatitis E virus is dependent on its ability to undergo retrotranslocation from the endoplasmic reticulum[J].J Virol,2007,81(7):3339-3345.

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Expression of C-terminal Major Epitope Domain of ORF2 of SHEV inE.coli

RAN Xu-hua,WEN Xiao-bo,WANG Mi,LI Dong-ye,HOU Xi-lin

(Provincial K ey Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultral University,Daqing,Heilongjiang,163319,China)

To express C-terminal major epitope domain of ORF2 of swine hepatitis E virus(SHEV)inE.coli,C-terminal major epitope domain in ORF2 was primarily mapped upon analysis of Bioinformatic software,according to the amino acid sequence of SHEV DQ1 strain in GenBank.A pair of specific primers were designed to amplify the fragment encoding the major epitope domain.This fragment was cloned into the multiple cloning site of pET30a(+)vector after subjecting to restriction endonuclease digestion.The recombinant plasmid was designated as pET30a-ORF2C,and was transformed intoE.coliBL21 competent cells.Expression of recombinant protein was induced by addition of final concentration of 1.0 mmol/L IPTG under 37℃condition.Results showed that the length of RT-PCR product of interest is 301 base pairs,the size of recombinant protein is 18 ku.The result of Western blot showed that the recombinant protein specifically reacted with serum against SHEV,suggesting the recombinant protein had wonderful specificity,and can be used as antigen in diagnostic assay for measuring antibodies against SHEV in clinical practice.

Swine hepatitis E virus;ORF2;major epitope domain;expression

Q786;S852.659.6

A

1007-5038(2010)01-0024-04

2009-08-21

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項目(11521201)

冉旭華(1978-),女,黑龍江人,副教授,博士,主要從事動物病毒分子生物學(xué)研究。*通訊作者