奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及SRY基因性別鑒定*

陳華濤,胡林勇,楊 艷,李 倩,靳亞平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生殖生理和胚胎工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵 712100)

奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及SRY基因性別鑒定*

陳華濤,胡林勇,楊 艷,李 倩,靳亞平*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生殖生理和胚胎工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵 712100)

為了探索和建立奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及性別鑒定的技術(shù)方法,獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊的供體細(xì)胞,本試驗(yàn)用組織塊培養(yǎng)法分離純化得到兩株奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞周期和倍性分析。同時(shí)根據(jù)GenBank上發(fā)布的山羊SRY基因設(shè)計(jì)合成一對(duì)PCR引物作為性別鑒定引物,另外根據(jù)山羊BLG基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物作為內(nèi)參引物,建立PCR反應(yīng)體系對(duì)兩株胎兒成纖維細(xì)胞系進(jìn)行性別鑒定。結(jié)果表明,分離的胎兒成纖維細(xì)胞活力良好,可在體外快速生長(zhǎng)、增殖、穩(wěn)定培養(yǎng);陽性對(duì)照和山羊胎兒成纖維細(xì)胞系2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到337 bp片段和498 bp的BLG基因片段,而陰性對(duì)照和山羊胎兒成纖維細(xì)胞系1經(jīng)PCR擴(kuò)增得到498 bp的β-乳球蛋白基因片段。將337 bp片段和pMD19-T載體連接,構(gòu)建重組載體pSRY,通過測(cè)序證明337 bp片段為SRY基因片段。這說明有337 bp擴(kuò)增帶的細(xì)胞系為雄性,無337 bp擴(kuò)增帶的細(xì)胞系為雌性。本試驗(yàn)為轉(zhuǎn)基因奶山羊新品種的培育奠定了基礎(chǔ)。

奶山羊;成纖維細(xì)胞;SRY基因;性別鑒定

*通訊作者

近年來,基于細(xì)胞核移植技術(shù)及細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,為精確改造家畜的基因型提供了比傳統(tǒng)的育種篩選方案更為直接快速的方法。通過體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因牛[1-3]、綿羊[4]、豬[5]、山羊[6-7]等動(dòng)物。胎兒成纖維細(xì)胞容易分離,培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染,適合作為供體細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植技術(shù)來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其已經(jīng)成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物所普遍應(yīng)用的體細(xì)胞系。然而,體細(xì)胞系有一個(gè)主要的缺點(diǎn),細(xì)胞的壽命是有限的。它們的增殖能力取決于動(dòng)物種類,山羊和綿羊成纖維細(xì)胞增殖次數(shù)在40～120之間,牛和豬成纖維細(xì)胞增殖次數(shù)在30～50之間[8-10]。不同個(gè)體分離的胎兒成纖維細(xì)胞系,其活力也存在差別。

奶山羊具有妊娠周期短、產(chǎn)奶量較綿羊高、抗病力強(qiáng)及飼養(yǎng)成本低的優(yōu)點(diǎn),使其成為了理想的轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物。為了獲得具有體外傳代次數(shù)多,基因組穩(wěn)定,活力強(qiáng)的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系,本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,從配種后30 d奶山羊胎兒中分離培養(yǎng)胎兒成纖維細(xì)胞,并用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng),在傳代過程中觀察總結(jié)了體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特征,用PCR法鑒定了胎兒性別,為后續(xù)山羊體細(xì)胞克隆與胚胎移植及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶山羊新品種的培育奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用材料 配種后30 d的奶山羊胎兒、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照羊血液,取自西北農(nóng)林科技大學(xué)克隆羊基地。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12,Gibco產(chǎn)品;胰蛋白酶,二甲基亞砜(DMSO)以及其他無機(jī)鹽為Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS),Hyclone公司產(chǎn)品;蛋白酶K、基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒,天根公司產(chǎn)品;pMD19T載體、Taq酶,Takara公司產(chǎn)品;二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT);青霉素和鏈霉素,哈藥集團(tuán)制藥總廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司);Conic,XDS-1B(組織培養(yǎng)倒置顯微鏡);BB5060UV CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus公司);U410-86超低溫冰箱(NBS公司);5430R高速離心機(jī)(Eppendorf公司);ZHWY-100B恒溫振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),TC-96/G/H梯度PCR儀(杭州博日科技有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 通過外科手術(shù)法,無菌操作取出2只配種后30 d的胎兒,迅速將其放入盛有PBS溶液的保溫杯內(nèi),溶液內(nèi)含有雙抗。1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,并迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi),于培養(yǎng)皿內(nèi)加750 mL/L的乙醇浸泡1 min,然后用PBS沖洗胎兒3次。將胎兒轉(zhuǎn)入另一加入PBS的培養(yǎng)皿中,去除四肢、頭部和內(nèi)臟。余下的組織在無菌PBS液中洗滌2次～3次后轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶?jī)?nèi),用眼科剪刀,將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移到60 mm培養(yǎng)皿中,并借助彎頭吸管使組織塊均勻分布于生長(zhǎng)面。將培養(yǎng)皿倒置與37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng) 5 h～6 h后,待組織塊周圍開始變干前加入4 mL含100 mL/L胎牛血清和200單位/mL雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)2 d～3 d時(shí),成纖維細(xì)胞從組織塊周圍蔓延生長(zhǎng)出來,將原來的培養(yǎng)液換為等量的新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),此后每隔 3 d觀察換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí),將一部分細(xì)胞凍存起來,一部分按1∶5的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系的性別鑒定

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中檢索得到山羊SRY基因全序列,運(yùn)用Primer Primenr5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物:SRYU 5′-GAACGAAGACGAAAGGTGGC-3′,SRYD 5′-GGGACTGTGAGCGGCATAAT-3′,預(yù)期產(chǎn)物為337 bp。根據(jù)β-乳球蛋白基因序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)合成1對(duì)內(nèi)標(biāo)引物:BLGU 5′-CACTTGTTCGCCTAAATCCG-3′,BLGD 5′-AGCCTCACTGTCAACTCTGC-3′,預(yù)期產(chǎn)物為498 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2.2 基因組DNA的提取 用天根血液、細(xì)胞、基因組提取試劑盒提取奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA,陰性、陽性對(duì)照羊血液基因組DNA,作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.2.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 采用50 μ L反應(yīng)體系,以山羊基因組DNA為模板,其中基因組模 板 為 2 μ L,10 × PCR buffer(Mg2+)5 μ L,10 mmol/L dNTP Mixture 4 μ L,引 物 各 1 μ L(20 μ mol/L),TaqPolymerse 0.5 μ L,ddH2O 34.5 μ L;PCR擴(kuò)增條件為:94℃3 min;94℃30 s,59℃30 s,72℃20 s,30個(gè)循環(huán);72℃8 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.2.4 pSRY重組質(zhì)粒的構(gòu)建、測(cè)序及同源性分析 SRY基因PCR產(chǎn)物用天根膠回收試劑盒回收,膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體按5∶1摩爾數(shù)的比例混合,10 μ L連接反應(yīng)體積中含 SolutionⅠ5 μ L,16 ℃連接 3 h,轉(zhuǎn)化 200 μ L 感受態(tài) DH5α后,涂布于含60 μ g/mL氨芐青霉素的SOB固體培養(yǎng)板上(含X-gal/IPTG),37℃培養(yǎng)過夜,挑取白色菌落,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定,目標(biāo)重組質(zhì)粒命名為pSRY。將pSRY重組質(zhì)粒用M13通用引物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank上的SRY基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 MT T法生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取第4代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,常規(guī)消化進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按2×104/mL的密度接種于 96孔培養(yǎng)板,每孔接種150 μ L。從接種時(shí)間算起,每隔 24 h選取 3孔吸棄50 μ L培養(yǎng)液后加入20 μ L MTT 溶液(5 mg/mL),37℃繼續(xù)孵育4 h,4 h后將各孔中的每一孔吸棄100 μ L液體,盡量避免將針狀結(jié)晶棄掉,各孔加入150 μ L DMSO溶解緩沖液,37℃過夜。于次日將處理好的3孔液體轉(zhuǎn)入另一96孔板,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上,于492 nm處以加入MT T溶液和DMSO溶解緩沖液的培養(yǎng)液調(diào)“0”,測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果。以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),平均OD值為縱坐標(biāo)作生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞增殖周期測(cè)定及細(xì)胞倍性分析 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代和第15代的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞,將消化下來的細(xì)胞分別用2.5 mL的PBS洗滌2次(800 r/min～1 000 r/min離心5 min),棄上清,然后加入1 mL的PBS將細(xì)胞混勻,再加入2 mL無水乙醇立即震蕩混勻,封口膜封口,置于冰盒送檢,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和DNA倍體。

2 結(jié)果

2.1 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系的分離培養(yǎng)

通過外科手術(shù)法,獲得了2只30 d的奶山羊胎兒(圖1)。按照細(xì)胞原代培養(yǎng)的組織塊培養(yǎng)法得到了胎兒的原代成纖維細(xì)胞,并通過細(xì)胞傳代分別獲得了GFF1、GFF2兩株胎兒成纖維細(xì)胞系,分別來自這2只胎兒。組織塊培養(yǎng)第3天,細(xì)胞從組織塊游離出,此時(shí)的細(xì)胞混有一部分上皮樣細(xì)胞(圖2)。培養(yǎng)7 d時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)良好,活力旺盛,鋪滿皿底(圖3)。

圖1 30 d胎兒Fig.1 Goat fetus of 30 day s

圖2 培養(yǎng)3 d時(shí)成纖維細(xì)胞遷移生長(zhǎng)出組織塊(40×) Fig.2 T he growth and emigration of fetal fibroblasts in vitro at 3 days(40×)

2.2 胎兒成纖維細(xì)胞系的性別鑒定

圖3 培養(yǎng)7 d時(shí)長(zhǎng)至成纖維細(xì)胞匯合(40×)Fig.3 The confluence of fetal fibroblasts in vitro at 7 days(40×)

分別以公山羊、母山羊血液基因組為陽性、陰性對(duì)照,檢測(cè)了GFF1、GFF2兩株細(xì)胞系。結(jié)果顯示,陽性對(duì)照組及GFF2擴(kuò)增出337 bp(SRY基因)和498 bp(BLG內(nèi)參)大小的兩個(gè)條帶,而陰性對(duì)照及GFF1只擴(kuò)增出498 bp的一個(gè)條帶,這表明GFF1為雌性細(xì)胞系,GFF2為雄性細(xì)胞系(圖4)。

圖4 山羊胎兒成纖維細(xì)胞系SRY-PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.4 Amplified results of goat fetal fibroblasts by SRY-PCR

2.3 奶山羊SRY基因序列測(cè)序與同源性分析結(jié)果

將PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選,成功構(gòu)建pSRY載體,挑選陽性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果如圖5所示。測(cè)序結(jié)果與NCBI上發(fā)表的SRY基因序列99%同源,更進(jìn)一步說明了性別鑒定結(jié)果的正確性。

圖5 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig.5 The sequencing results of PCR products

2.4 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

從生長(zhǎng)曲線可見,奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞接種后第1～2天生長(zhǎng)較慢,第3天開始快速生長(zhǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第5天到達(dá)高峰期,隨后進(jìn)入平臺(tái)期,第7天細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,細(xì)胞開始死亡(圖6)。

2.5 細(xì)胞周期測(cè)定及細(xì)胞倍性分析結(jié)果

奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞第4代(T0)和第15代(T15)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖7、圖8所示,數(shù)據(jù)分析見表1。

(1)計(jì)算不同代次細(xì)胞的DNA指數(shù)(DI):第4代細(xì)胞為正常二倍體對(duì)照細(xì)胞,DI=70.88(T15)/69.23(T0)=1.02≈1.0,根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn),DI=1.00±0.1為二倍體,說明第15代胎兒成纖維細(xì)胞細(xì)胞仍為正常的二倍體細(xì)胞。此細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)傳代后,染色體倍體仍正常。此胎兒成纖維細(xì)胞系可用于后續(xù)的核移植和細(xì)胞篩選試驗(yàn)。

(2)計(jì)算不同代次細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI):PI(T0)=%(G2+S)=90.33%,PI(T15)=%(G2+S)=91.69%,這兩個(gè)代次細(xì)胞增殖指數(shù)讀很高,且相差不大,說明奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞活力很強(qiáng),經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的傳代后,其增殖能力基本沒有變化。為以后細(xì)胞經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間的藥物篩選提供前提條件。

圖6 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.6 T he growth curve of fetal fibroblasts of dairy goat

表1 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞第4代和第15代細(xì)胞生長(zhǎng)周期比較Table 1 The comparison of cell growth cycle between passage 4 cells and passsage 15 cells

圖7 第4代胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期Fig.7 The cell growth cycle of passage 4 cells

圖8 第15代胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期Fig.8 The cell growth cycle of passage 15 cells

3 討論

3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

當(dāng)前對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)比較常用的方法主要有兩種,即組織塊貼壁培養(yǎng)法和分離單細(xì)胞接種培養(yǎng)法。組織塊貼附法具有簡(jiǎn)單方便,細(xì)胞均質(zhì)性好,易于操作,避免對(duì)細(xì)胞造成傷害,節(jié)約費(fèi)用和成功率高等優(yōu)點(diǎn),培養(yǎng)動(dòng)物成纖維細(xì)胞多采用此法[11-12]。分離單細(xì)胞接種培養(yǎng)法雖然也可以較好的培養(yǎng)細(xì)胞,但消化酶對(duì)細(xì)胞的傷害較大,會(huì)影響原代細(xì)胞的存活率和貼壁率。因此,本試驗(yàn)選用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。屠迪等[13]研究表明,組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的牦牛原代胎兒成纖維細(xì)胞和早期傳代細(xì)胞中,會(huì)混有較多的上皮樣細(xì)胞,需要多次傳代才能得到高純度的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞相比,對(duì)消化液敏感性強(qiáng),通過控制適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間可以純化細(xì)胞,一般經(jīng)3次～5次傳代純化,就可以得到較純的成纖維細(xì)胞[14]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果和上述研究相一致,奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞原代及前3代都混有一些上皮樣細(xì)胞,直到第4代才分離到純化的胎兒成纖維細(xì)胞。另外,原代細(xì)胞的培養(yǎng)中,污染成為困擾著我們的一個(gè)常見問題,本試驗(yàn)在原代細(xì)胞的培養(yǎng)液里加入了200單位/mL的雙抗,很好的防止了原代細(xì)胞的污染,這和馬忠輝等[15]的做法相同。本試驗(yàn)分離的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線呈“S”型,細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的3個(gè)分期,潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。接種第1～2天的細(xì)胞處于恢復(fù)期,細(xì)胞數(shù)量基本變化不大;從第2天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;3 d～5 d為增殖高峰期,5 d后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞逐漸長(zhǎng)滿,7 d后細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制而開始死亡。該細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明,符合體外細(xì)胞的生長(zhǎng)特征,具有正常的細(xì)胞生物學(xué)特性。對(duì)體細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而言,從細(xì)胞轉(zhuǎn)染到獲得陽性克隆至少需要20 d以上,相當(dāng)于細(xì)胞8代以上。到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行核移植時(shí),細(xì)胞在體外至少培養(yǎng)了10代以上,因而核供體細(xì)胞需要有較好的增殖活性而又不容易發(fā)生染色體的畸變。本試驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定第4代和第15代奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期和倍性。通過對(duì)這兩代細(xì)胞測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,以第4代胎兒成纖維細(xì)胞作為二倍體對(duì)照,第15代細(xì)胞仍為二倍體細(xì)胞,沒有發(fā)生染色體變異。另外,細(xì)胞周期分析表明,細(xì)胞在體外傳了15代后,其增殖活性仍然很好,和第4代細(xì)胞相比,沒有多大變化。因而此細(xì)胞系可以用于細(xì)胞篩選,在獲得陽性克隆后作為轉(zhuǎn)基因克隆的供體細(xì)胞。

3.2 SRY-PCR法胎兒性別鑒定

目前性別鑒定的方法有許多種,如染色體核型分析法,細(xì)胞免疫學(xué)方法,DNA探針法及SRY-PCR法等。這幾種方法相比較,SRY-PCR方法具有特異性強(qiáng),靈敏度高,操作方便快捷且準(zhǔn)確(準(zhǔn)確率達(dá)95%～100%)的優(yōu)點(diǎn),因而成了一種廣泛應(yīng)用的方法。SRY是在不同動(dòng)物中高度保守的雄性Y染色體上性別決定區(qū)的基因[16]。SRY基因的表達(dá)決定了胚胎向雄性方向分化,因此可通過特異性擴(kuò)增SRY基因的核心序列對(duì)動(dòng)物胚胎或細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定。曾溢濤等通過對(duì)SRY基因核心序列HMG盒測(cè)序設(shè)計(jì)引物對(duì)奶牛胚胎進(jìn)行性別鑒定,準(zhǔn)確率達(dá)100%[17]。Harely V R等[18]從SRY基因核心序列以外的片段擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定了人和牛早期胚胎的性別。本試驗(yàn)根據(jù)設(shè)計(jì)的SRY基因擴(kuò)增引物可以從陽性對(duì)照公山羊血液基因組有效的擴(kuò)增出337 bp的預(yù)期片段,而陰性對(duì)照母山羊血液基因組卻未能擴(kuò)增出該片段。說明,含有相同337 bp特性一片段GFF2為雄性細(xì)胞系,而不含該特異性條帶的GFF1為雌性細(xì)胞系。序列測(cè)定及同源性分析進(jìn)一步證明擴(kuò)增產(chǎn)物為SRY基因片段,說明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可用于PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確鑒定山羊胎兒成纖維細(xì)胞的性別。PCR擴(kuò)增技術(shù)的高靈敏性,極易受到污染,影響鑒定結(jié)果。因而在操作過程中要注意,比如要建立空白對(duì)照,吸頭、離心管均高壓滅菌,一次性使用;戴一次性手套,配制PCR預(yù)混液等,盡量減少因操作不當(dāng)而造成的污染。另外,本試驗(yàn)采用了復(fù)合PCR,就是在同一個(gè)反應(yīng)環(huán)境中,使用多對(duì)PCR引物對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增。我們根據(jù)山羊β-乳球蛋白基因設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物,同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。這樣可以避免因基因組提取不當(dāng)或操作過程中的失誤而造成的假陰性。

本試驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了兩株奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系,并對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行了SRY-PCR性別鑒定,GFF1為雌性,GFF2為雄性。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與細(xì)胞周期及倍性分析表明,這兩株細(xì)胞系活力旺盛,能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng),適于作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞,為高產(chǎn)優(yōu)勢(shì)奶山羊新品種的培育奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and Culture of Diary Goat Fetal Fibroblasts and Sex Indentification by SRY Gene

CHEN Hua-tao,HU Lin-yong,YANG Yan,LI Qian,JIN Ya-ping

(Key Laboratory of Animal Reproductive Endocrinology and Embryo Biotechology of Agriculture Ministry of China,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Y angling,Shaanxi,712100,China)

In order to explore and establish the method for isolation,cultivation,and sex identification of dairy goat fetal fibroblasts(GFFs)in vitro,obtain the donor cells for dairy goat transgenic cloning,two dairy goat fetal fibroblast cell lines passing through separation and purify were obtained by tissue explant attachment.The GFFs were examined by cell morphology,growth curve,cell cycle and DNA ploidy.A pair of PCR primers were designed to identify the sex of GFF cell lines according to the goat SRY gene,the other pair of inner reference PCR primers were designed according to the goat BLG gene,the SRY-PCR reaction system was established and the two GFF cell lines were identified.T he cytological bioactivity of the isolated cell lines was excellent,they could grow and proliferate quicklyin vitro.T he positive control sample and GFF2 sample obtained the PCR fragment of 337 bp and the BLG gene PCR fragment of 498 bp.However,the negative control sample and the GFF1 sample did not amplify the PCR fragment of 337 bp.The PCR fragment of 337 bp was cloned into pMD19-T vector and the pSRY recombinant vector was constructed,then the vector was sequenced by M13 universal primers.The result of sequence determined that the corresponding gene is partial SRY gene fragment.The result indicated that the cell line with 337 bp fragment is male.This study laid the foundation for breeding new breed of transgenic dairy goat.

dairy goat;fetal fibroblast;SRY gene;sex identification

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0001-07

2010-05-14

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2008ZX08008-004)

陳華濤(1984-),男,安徽碭山人,碩士研究生,主要從事家畜生殖內(nèi)分泌與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種培育研究。