紅花黃色素對(duì)家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax蛋白表達(dá)的影響

徐傳金 張文忠 馮培青 蔡尚郎

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,山東 青島 266003)

紅花黃色素(safflower yellow,SY)是從紅花中提取的有效成分〔1,2〕,是臨床常用的活血化瘀藥物。現(xiàn)代藥理研究表明,紅花水煎劑能抑制血小板聚集,降低血液黏稠度〔3〕,其有效成分SY能延長凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間〔4〕。SY具有提高心肌和血漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,加速自由基的清除等作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察 SY對(duì)家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響,驗(yàn)證其對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用,并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康新西蘭大白兔 24只(購自河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心),雌雄不分,體重 2.0～2.5 kg,隨機(jī)分為 3組,每組 8只。缺血再灌注組(IR組):結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支1 h,再灌注 6 h。SY組:于再灌注前 10 min耳緣靜脈注射 SY 10 mg/kg,余同 IR組。藥物組(MI組):于再灌注前 5min耳緣靜脈注射磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制劑 LY 294002(0.3 mg/kg),余同 SY組。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型制備 采用烏拉坦(1 g/kg)耳緣靜脈注射麻醉。仰臥位固定,心電圖導(dǎo)線與兔四肢相連,記錄12導(dǎo)聯(lián)心電圖,連接心電監(jiān)護(hù)。除毛,沿胸骨正中偏左 0.5 cm切開皮膚,暴露左側(cè) 3、4肋骨,鈍性分離肋間肌,小彎鉗于肋下穿 10號(hào)縫合線 2根,分別結(jié)扎,沿結(jié)扎線正中剪斷 3、4根肋軟骨;牽拉兩側(cè)結(jié)扎線,暴露胸腔,分離脂肪組織,可見心包及搏動(dòng)之心臟。提起心包膜正中,用眼科剪將心包膜前部剪開,將心包膜用縫線固定于胸壁,充分暴露心臟。用止血鉗將左心耳輕輕提起,觀察冠脈的走行。以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志,在左心耳根部下方 2 mm處,用持針器持小圓針在冠狀動(dòng)脈前降支根部穿一結(jié)扎線,結(jié)扎線穿過心肌表層,在肺動(dòng)脈圓錐旁穿出;在該結(jié)扎線下方約 0.5 cm處再穿一結(jié)扎線,雙重結(jié)扎左前降支1 h,再灌注 6 h。心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬高為結(jié)扎成功。

1.2.2 心肌細(xì)胞光鏡學(xué)觀察 各組動(dòng)物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。實(shí)驗(yàn)步驟如下:取材→固定→脫水和透明→透蠟→包埋→切片及貼附→脫蠟復(fù)水→染色→水洗→分化→漂洗→復(fù)染→透明→封藏,切片經(jīng)中性樹膠封藏,等樹膠干后就可在鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 心肌細(xì)胞電鏡學(xué)觀察 各組動(dòng)物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織進(jìn)行超薄切片觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。實(shí)驗(yàn)步驟如下:①取材:取缺血再灌注區(qū)組織,制成 1 mm3的組織塊;②2.5%戊二醛 4℃固定 4 h;③磷酸緩沖液(PBS)漂洗 3次;④1%鋨酸固定 3 h;⑤PBS漂洗 3次;⑥脫水;⑦浸透:用二甲基酮與 Epon812包埋劑混合液(1∶2)浸透;⑧包埋:將樣品移到 Epon812包埋劑中進(jìn)行包埋;⑨超薄切片:用 UltracutE超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片,厚度為 50～100 nm,干燥后即可染色;⑩染色:醋酸雙氧鈾染色 15 min,蒸餾水徹底水洗 3次;枸櫞酸鉛染色 15min,再用蒸餾水徹底水洗 3次。切片干燥后即可置于電子顯微鏡(日本JEOL公司JEM-1200EX透射電鏡)下觀察。1.2.4 原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(Tunel法)檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇 5個(gè)視野(×400),記錄陽性染色的心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù),以凋亡細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比來確定凋亡指數(shù)(AI)。AI=Tunel陽性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù) ×100%。

1.2.5 心肌細(xì)胞中 bcl-2、bax蛋白表達(dá)的免疫組化(SP)法檢測 將取材中 10%中性甲醛固定的標(biāo)本固定 24h后行常規(guī)石蠟包埋、切片,厚度約 4.5μm,貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。①二甲苯和酒精脫蠟;②3%過氧化氫孵育 10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS液沖洗;③5%～10%正常山羊血清封閉,室溫孵育 10 min;④加入一抗:bcl-2、bax均為 1∶100稀釋后加入玻片中,4℃過夜,PBS液洗 3次,每次 5 min;⑤加入二抗:滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗,37℃孵育 30 min,PBS洗 3次,每次 5min。⑥顯色:加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑 5～10 min;⑦HE復(fù)染 2 min,脫水、透明、封片、鏡檢。每張切片隨機(jī)選取 5個(gè)視野(×400)采用 VIDAS圖像分析系統(tǒng)(德國歐波同公司)測定其陽性表達(dá)面積、平均光密度和積分光密度,并采用公式:單位面積平均光密度 =〔積分光密度/(512×512)〕×100%進(jìn)行數(shù)據(jù)換算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 x±s表示,使用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,組內(nèi)比較采用方差分析,兩組間比較采用 q檢驗(yàn)(Student Newman-Keuls法)。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡學(xué)觀察 IR組心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫,細(xì)胞界限不清,可見較多粒細(xì)胞灶狀浸潤,并可見少量紅細(xì)胞滲漏。SY組心肌細(xì)胞輕度水腫,界限清楚,心肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則,見少量粒細(xì)胞浸潤,無紅細(xì)胞滲漏。MI組心肌細(xì)胞水腫嚴(yán)重,部分細(xì)胞溶解,細(xì)胞界限欠清楚,橫紋消失,可見較多粒細(xì)胞浸潤,并可見紅細(xì)胞滲漏。

2.2 電鏡下觀察 IR組心肌細(xì)胞水腫明顯;線粒體明顯腫脹,溢出到細(xì)胞外,嵴明顯減少,基質(zhì)中致密顆粒減少甚至消失,伴空泡樣形成;肌膜破壞,出現(xiàn)膜斷裂、缺損,肌原纖維模糊,部分 Z線不明顯;細(xì)胞核腫脹,異染色質(zhì)增多,核不規(guī)則,甚至核碎裂。SY組超微結(jié)構(gòu)變化輕微,僅見心肌細(xì)胞內(nèi)輕度水腫;線粒體輕度腫脹,嵴部分消失;肌原纖維排列規(guī)則,肌小節(jié)清楚,僅見少量肌絲斷裂,Z線明顯,閏盤清晰;細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)分布均勻,無核裂解及固縮現(xiàn)象。MI組細(xì)胞水腫明顯,胞膜固縮消失;線粒體彌漫性腫脹,;糖原減少,肌原纖維極度松弛、拉長,Z線扭曲、變形,肌絲橫斷、撕裂、溶解;核固縮,可見凋亡小體;間質(zhì)明顯水腫。

2.3 凋亡細(xì)胞 Tunel檢測結(jié)果 IR組AI為 21.37±3.86,SY組 AI明顯降低(15.47±3.63)(P＜0.01),而 MI組 AI(23.38±3.77)與 IR組接近(P＞0.05)。

2.4 心肌細(xì)胞中 bcl-2、bax蛋白的表達(dá) bcl-2陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿及胞膜呈棕褐色,bax陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕褐色。著深棕色者為強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞,不著色者為陰性表達(dá)細(xì)胞,介于兩者之間者為弱陽性表達(dá)細(xì)胞。各組心肌細(xì)胞bcl-2、bax蛋白表達(dá)見表 1。

表1 各組心肌細(xì)胞 AI、bcl-2、bax蛋白表達(dá)(x±s,%)

3 討 論

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo),心肌缺血 30～40 min,心肌細(xì)胞可發(fā)生缺血性損害。光鏡下觀察見正常心肌細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤等損傷。線粒體對(duì)缺血缺氧十分敏感,是決定細(xì)胞由可逆到不可逆改變的關(guān)鍵細(xì)胞器,線粒體彌漫性腫脹,膜破裂、嵴溶解、消失,基質(zhì)出現(xiàn)嗜鋨性顆粒等均是缺血造成的損傷。本研究發(fā)現(xiàn),SY可以減輕心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,從而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體的正常細(xì)胞在受到生理性或病理性刺激后啟動(dòng)的自發(fā)死亡過程是缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)〔6〕。大多數(shù)細(xì)胞在凋亡過程中需要新基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。bcl-2基因是凋亡抑制基因,其過量表達(dá)可阻斷因缺血、細(xì)胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、c-myc等不同刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。bcl-2抑制凋亡的機(jī)制是它可直接或間接地阻止細(xì)胞色素 C自線粒體的釋出,而后者可與 ATP一起改變Apaf-1的構(gòu)型而使caspase-9激活。bax基因?yàn)榇龠M(jìn)凋亡基因,主要表達(dá)于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。bax與 bcl-2有很高的同源性,能與 bcl-2形成異源二聚體,通過抑制后者的活性,使凋亡易于發(fā)生。bcl-2和 bax的表達(dá)程度決定了細(xì)胞命運(yùn),bcl-2占優(yōu)勢時(shí)阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生,而 Bax占優(yōu)勢時(shí)細(xì)胞趨向凋亡〔7〕。本研究采用 Tunel法、SP技術(shù)檢測了心肌細(xì)胞 AI及bcl-2、bax蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示各組均有一定的心肌細(xì)胞凋亡,而 SY組 AI明顯較低,證實(shí)了 SY可以減輕缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡程度;同時(shí)發(fā)現(xiàn)SY組 bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng),而 bax蛋白表達(dá)明顯減少,進(jìn)一步顯示,SY對(duì)缺血再灌注心肌凋亡相關(guān)基因的表達(dá)具有顯著的作用,即明顯上調(diào) bcl-2的表達(dá)、下調(diào)bax的表達(dá),從而發(fā)揮對(duì)心肌的靶保護(hù)作用。

目前認(rèn)為缺血預(yù)處理的機(jī)制是短暫的缺血再灌注使大量的內(nèi)源性物質(zhì)如腺苷、緩激肽、阿片等釋放〔7〕,然后作用于相應(yīng)的受體,誘導(dǎo)蛋白激酶C(PKC)的激活,再進(jìn)一步激活其他激酶,最終激活再灌注損傷補(bǔ)救酶(RISK)途徑,使效應(yīng)器磷酸化,效應(yīng)器可能主要是線粒體上的 ATP敏感性鉀通道(mKATP),誘導(dǎo)心肌保護(hù)機(jī)制〔8〕。 PI3K是 RISK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成之一〔9〕。本研究通過應(yīng)用藥物 PI3K抑制劑 LY294002發(fā)現(xiàn),該藥物能夠阻斷 SY對(duì)心臟的保護(hù)作用,因此推測RISK參與了 SY對(duì)心肌的保護(hù)作用,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

1 李中原,涂秀華.紅花黃色素的藥理研究進(jìn)展〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2005;16(2):153-6.

2 李 芳,孫明智.紅花黃色素對(duì)豚鼠心室乳頭肌缺氧和復(fù)氧損傷的保護(hù)作用〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999;33(1):6-8.

3 顧紅璋.中藥紅花煎劑對(duì)血小板聚集功能的影響〔J〕.中國血液流變學(xué)雜志,1994;2:48.

4 黃正良,崔程梅,任 遠(yuǎn).紅花黃色素的抗凝血作用研究〔J〕.中成藥,1987;18(4):22.

5 劉月慶,李 康,畢開順.紅花黃色素 A在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究〔J〕.中草藥,2003;34(8):725-7.

6 吳 青,陶紅凱,陶大昌,等.缺血再灌注誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的研究〔J〕.中國心血管病研究雜志,2004;2(11):905-8.

7 孫忠東,高尚志,池一凡,等.腎缺血預(yù)處理對(duì)兔未成熟心肌 Bcl-2,Bax,Fas蛋白表達(dá)的影響〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005;26(22):2039-41.

8 Philipp S,Yang XM,Cui L,et al.Postconditioning protects rabbit hearts through a protein kinase C-adenosine A(2b)receptor cascade〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2):308-14.

9 Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al.Postconditioning:a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinosito-kinase-Akt pathway〔J〕.Circ Res,2004;95(3):230-2.