熒光法測定醛糖還原酶活性的優(yōu)化

王俊杰 方會(huì)龍 段小毛 肖和平 谷 娟 李 玲 歐陽冬生

(中南大學(xué)臨床藥理研究所,湖南 長沙 410003)

醛糖還原酶(Aldose Reductase,AR)是葡萄糖代謝多元醇通路的限速酶,高血糖可激活A(yù)R,使葡萄糖經(jīng)多元醇通路的代謝增強(qiáng),造成山梨醇在細(xì)胞內(nèi)的蓄積和還原劑如還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的缺失,導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損而干擾細(xì)胞的正常代謝。動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)均提示,高血糖激活A(yù)R是糖尿病并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一〔1〕。最新研究發(fā)現(xiàn) AR還在心肌缺血〔2〕及內(nèi)毒素引起的休克反應(yīng)〔3〕中發(fā)揮著重要作用。因此,測定紅細(xì)胞AR活性,對(duì)研究AR與相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系具有重要意義。目前測定 AR活性有熒光法和比色法。紅細(xì)胞 AR活性測定多采用熒光法〔4〕,其原理為 NADP與強(qiáng)堿作用產(chǎn)生熒光信號(hào),其強(qiáng)度與NADP的濃度成正比,咪唑可保護(hù)熒光的穩(wěn)定性,當(dāng)定量且過量的 NADPH存在時(shí),以 DL-甘油醛為底物,可通過測定NADP的生成或NADPH的減少來反映 AR活性。新近有研究顯示 NADP生成法靈敏度和重復(fù)性更好〔5〕,為此,我們對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 雄性 10周齡 SD大鼠 20只,由中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,隨機(jī)分成 2組:對(duì)照組和糖尿病組。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 NADPH(純度 ＞98%,ROTH公司),NADP(純度 ＞90%,ROTH公司),DL-甘油醛(Wako公司),鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。熒光分光光度計(jì)(日本產(chǎn)島津 RF-5000),京都血糖儀(日本第一科學(xué)株式會(huì)社)。

1.2.2 大鼠糖尿病模型的復(fù)制 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d,禁食12 h,糖尿病組按 5.5 ml/kg體重單次腹腔注射 STZ溶液 (STZ用 0.1 mol/L pH 4.2的檸檬酸緩沖液配成 10 mg/ml的溶液),3 d后尾靜脈采血隨機(jī)測血糖≥13.5 mmol/L者為糖尿病大鼠,對(duì)照組注射等量檸檬酸緩沖液。飼養(yǎng)期間所有大鼠自由飲水進(jìn)食。4 w后眼眶采血,血糖儀測定血糖。

1.2.3 制備裂解紅細(xì)胞 4 w后,眼眶采血,取肝素抗凝血1 ml,3 000 r/min×10 min分離紅細(xì)胞,然后加 4倍體積 4℃預(yù)冷的生理鹽水,3 000r/min×10 min×3次離心洗滌紅細(xì)胞,按照50μl/支分裝 (一支實(shí)驗(yàn)管,其余備用),-20℃凍存。取凍存紅細(xì)胞加 200μl 10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0),振蕩溶解10 min,3 000r/min×10 min,去沉淀。

1.2.4 AR活性測定反應(yīng)體系 每份樣品一式三份,冰上操作,反應(yīng)體系(終濃度):135 mmol/L PBS,100 mmol/L硫酸銨,0.04 mmol/L DL-甘油醛,150 μmol/L NADPH,5 μl紅細(xì)胞溶血液,總體積 200μl。實(shí)驗(yàn)管加上述所有試劑,空白管以去離子水代替 NADPH。加入 DL-甘油醛后立即 37℃水浴反應(yīng)。

1.2.5 終止反應(yīng) 5 min后,將樣本同時(shí)放入冰浴中,加入600μl 0.5mol/L HCl后 60℃水浴 15 min來終止反應(yīng)并破壞反應(yīng)剩余的 NADPH。冰浴冷卻后加入 250μl 6%高氯酸3 000 r/min×10 min離心沉淀血紅蛋白,吸取上清 1 ml,-20℃凍存。

1.2.6 熒光值測定 加入 2 ml 6 mol/L NaOH(內(nèi)含10 mmol/L咪唑)37℃水浴 5 min激發(fā) NADP產(chǎn)生熒光,Ex 360nm/Em460 nm測定熒光強(qiáng)度。

1.2.7 血紅蛋白含量測定〔6〕用高鐵氰化血紅蛋白法。實(shí)驗(yàn)管加稀釋液 3 ml,紅細(xì)胞溶血液 12μl,空白管以去離子水代替紅細(xì)胞溶血液,混勻,靜置 5 min,以空白管調(diào)零測實(shí)驗(yàn)管在540nm的吸光度值,計(jì)算血紅蛋白含量 Hb(g/L)=OD540×367.7。每份樣品平行做三份取均值。

1.2.8 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算 AR活性 反應(yīng)體系與條件同上,去離子水代替紅細(xì)胞溶血液,NADP(0～1 000μmol/L)代替 NADPH,以NADP濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,求回歸方程。由方程求得 NADP生成量,以每分鐘產(chǎn)生1μmol NADP為 1個(gè)酶活性單位(U),計(jì)算 AR活性。

1.2.9 血紅蛋白對(duì)AR活性測量值的影響 ①按照以上實(shí)驗(yàn)方法分別測定在加入 2.5、4、5、6、10μl同一紅細(xì)胞溶血液的情況下激發(fā)的熒光強(qiáng)度;②在終止反應(yīng)后的NADP溶液中未加入250μl 6%高氯酸沉淀血紅蛋白,然后測定激發(fā)的熒光強(qiáng)度。

1.2.10 樣本的保存周期 以同一溶血液為標(biāo)本,測定反應(yīng)體系生成的 NADP溶液在 -20℃凍存 0、4、24 h,1、2、4 w后的NADP激發(fā)的熒光強(qiáng)度。

1.2.11 同一紅細(xì)胞溶血液激發(fā)熒光的水浴反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 ①37℃水浴 5 min后測量 NADP產(chǎn)生的熒光值;②37℃水浴 30 min后測量 NADP產(chǎn)生的熒光值;③37℃水浴60 min后測量 NADP產(chǎn)生的熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示,兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較(成組設(shè)計(jì))用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程 NADP標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:熒光強(qiáng)度 =2.828+1.419×NADP濃度,則 NADP濃度 =(熒光強(qiáng)度-2.828)/1.419。

2.2 血紅蛋白對(duì)AR活性測量值的影響 在未去除血紅蛋白的條件下,紅細(xì)胞溶血液在 2.5～10μl的范圍,熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞血紅蛋白量的增加而降低;在終止反應(yīng)后的 NADP溶液中加入 250μl 6%高氯酸沉淀血紅蛋白,熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞溶血液的含量升高而升高,提示紅細(xì)胞對(duì)熒光測量值有較大干擾。紅細(xì)胞溶血液 2.5、4、5、6、10μl各組未去除血紅蛋白測定的熒光值均低于去除血紅蛋白測定的熒光值(P＜0.05),見表 1。

表1 紅細(xì)胞溶血液在去除和未去除血紅蛋白條件下激發(fā)的熒光強(qiáng)度(x±s)

2.3 樣本的保存周期 -20℃凍存 4、24 h,1、2、4 w后的NADP溶液測定的熒光強(qiáng)度分別是:45.2±1.7,44.2±1.3,45.4±1.9,44.1±2.1,44.4±2.3與對(duì)照組(44.9±1.2)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 激發(fā)熒光的水浴反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 生成的NADP溶液加入含咪唑的 NaOH后,在 37℃水浴分別放置 5、30、60 min激發(fā)熒光值,各組間總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),各組間變異系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表 2。

表2 激發(fā)熒光的不同水浴時(shí)間測量的熒光強(qiáng)度(x±s)

2.5 各組大鼠血糖和紅細(xì)胞AR活性比較 糖尿病大鼠造模4 w后血糖為(22.72±3.42)mmol/L與對(duì)照組血糖(6.25±1.04)mmol/L比較顯著升高(P＜0.05)。糖尿病大鼠 AR活性(5.64±2.28)U/mg較對(duì)照組(1.45±0.98)U/mg顯著升高(P＜0.05)。

3 討 論

紅細(xì)胞 AR活性測定常采用熒光法,本實(shí)驗(yàn)中采用的是NADP生成熒光法,其測定步驟為:一定時(shí)間內(nèi)的反應(yīng),終止反應(yīng),激發(fā)熒光并測定熒光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、熒光值和蛋白含量計(jì)算 AR活性。體外測定AR活性的原理是,AR使底物DL-甘油醛轉(zhuǎn)化為 DL-甘油酸的同時(shí),NADPH被氧化成 NADP,NADP可進(jìn)一步與強(qiáng)堿作用產(chǎn)生熒光,熒光強(qiáng)度與其濃度成正比,加入咪唑可以在一定時(shí)間內(nèi)防止熒光強(qiáng)度衰減。因此通過測定NADP生成可以反映AR的活性。

本研究結(jié)果顯示,紅細(xì)胞溶血液在 2.5～10μl范圍內(nèi),未去除血紅蛋白測定的熒光值均低于去除血紅蛋白測定的熒光值,且隨著紅細(xì)胞溶血液的濃度增大,熒光值的差異也越大,提示血紅蛋白對(duì)熒光值影響較大,推測可能是由于血紅蛋白上的亞鐵離子與 NADP發(fā)生氧化還原反應(yīng)而減弱了熒光。終止反應(yīng)后用 6%高氯酸沉淀血紅蛋白可以避免熒光值的消減。

反應(yīng)體系生成的 NADP溶液是否能長期保存目前未見報(bào)道,我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NADP溶液經(jīng)過 4、24 h、1、2、4 w的貯存時(shí)間后激發(fā)熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。建議實(shí)驗(yàn)可以分段進(jìn)行,以提高效率,特別適合需要在別處使用熒光分光光度計(jì)的實(shí)驗(yàn)室。

目前測定紅細(xì)胞 AR活性的方法中,激發(fā)熒光的水浴反應(yīng)時(shí)間主要有 5、30、60min。結(jié)果顯示,37℃水浴 5min熒光強(qiáng)度已接近最大值,5～60 min激發(fā)的熒光值逐漸增大。5～30 min比 30～60 min AR活性變化的趨勢緩和,60 min的標(biāo)準(zhǔn)差高于5和 30 min,但變異系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但為提高實(shí)驗(yàn)效率,建議采用 37℃水浴 5 min的實(shí)驗(yàn)方案。

AR活性是通過 AR催化底物DL-甘油醛反應(yīng) 5 min后輔酶的改變來計(jì)算的。加入底物DL-甘油醛開始計(jì)時(shí),37℃水浴5 min加入HCl終止反應(yīng)后停止計(jì)時(shí)。由于一次有多個(gè)樣本需要終止反應(yīng)。因此建議樣本在 37℃水浴進(jìn)行反應(yīng)后,樣本同時(shí)置于冰浴中再加入 HCl終止反應(yīng),可減小實(shí)驗(yàn)誤差。

由于實(shí)驗(yàn)條件和方案的不一致,AR活性測量值會(huì)有差異,用優(yōu)化后AR活性測定的NADP生成法能夠準(zhǔn)確反映糖尿病大鼠紅細(xì)胞 AR活性的變化。

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