廣西巴馬壯族長(zhǎng)壽老人 p16基因甲基化

陳文成 潘尚領(lǐng) 覃志堅(jiān) 韋葉生 何印蕾 林偉雄

(右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室,廣西 百色 533000)

人的壽命與環(huán)境因素和遺傳因素均有很大的關(guān)系,其中惡性腫瘤是老年人易患的直接關(guān)系到壽限的疾病之一,而腫瘤的發(fā)生與機(jī)體的抑癌基因關(guān)系密切。p16基因是一種重要的抑癌基因,在細(xì)胞周期過(guò)程中扮演著非常重要的角色,p16基因缺失或突變已被證實(shí)是許多腫瘤發(fā)生的原因之一〔1〕。近年研究表明 p16基因與細(xì)胞衰老有著緊密的聯(lián)系。本文旨在探討健康巴馬壯族長(zhǎng)壽老人 p16基因甲基化程度,進(jìn)一步揭示其與長(zhǎng)壽的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 長(zhǎng)壽組 (LG)156例,年齡 90～105歲 (12名≥100歲),平均年齡 93.2歲,男 46例,女 110例。對(duì)照組 (CG)142例均為健康成年人,年齡 20～72歲,平均年齡34.8歲,男 57例,女 85例。研究對(duì)象均為居住在巴馬縣(主要是甲篆、鳳凰、西山等鄉(xiāng)鎮(zhèn))和東蘭縣 (主要是城關(guān)、長(zhǎng)樂(lè)、武篆、三石等鄉(xiāng)鎮(zhèn))的壯族人,據(jù)家譜均可逆查 8代以上。LG老人均為巴馬縣長(zhǎng)壽研究所和東蘭縣老干局老齡辦建檔并長(zhǎng)期隨訪(fǎng)的對(duì)象。CG為同一地理區(qū)域內(nèi)無(wú)血緣關(guān)系、隨機(jī)抽樣的成年人,生活習(xí)慣及勞動(dòng)條件與 LG組均基本相同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象采靜脈血 2 ml,加ACD抗凝,用經(jīng)典的苯酚/氯仿抽提法提取白細(xì)胞 DNA〔2〕。用 TE溶液溶解DNA樣本置 4℃待用。

1.2 主要試劑 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔3〕的報(bào)道,甲基化及非甲基化引物擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度分別是150 bp和 151 bp,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。p16甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′;下游 5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′,p 16非甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′;下 游 5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′。 dNTPs、Taq DNA聚合 酶 (含 10 ×buffer、MgCl2)、小牛血清(BSA)、二甲亞砜(DMSO)等均為華美公司產(chǎn)品。DNA Marker為宕生物工程有限公司產(chǎn)品。瓊脂糖為西班牙進(jìn)口,由上海Yito Enterprise有限公司分裝提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 按照 Herman等〔4〕描述的甲基化特異性 PCR(methylation specific PCR,MSP)方法,并參考文獻(xiàn) 〔5〕進(jìn)行 p16基因甲基化的檢測(cè),其原理是DNA雙鏈變性解鏈后在亞硫酸氫鈉作用下堿基C轉(zhuǎn)化成U,但對(duì)于已發(fā)生甲基化的C則無(wú)此改變,據(jù)此設(shè)計(jì)兩對(duì)不同引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增即可檢測(cè)出此差異。步驟如下:①DNA修飾。取 50μl(2μg)經(jīng) TE溶液溶解 DNA樣品,加入新配的 3 mol/L NaOH 5.5μl,42℃水浴 30min。加入新配的 10 mmol/L氫醌 30μl和 3.9 mol/L亞硫酸氫鈉 (Sigma公司)510μl,加少許石蠟避光 55℃水浴16 h。②DNA純化。采用Wizard DNA純化系統(tǒng) (Promega),將去針頭的注射器針管固定于純化柱上,將上述 DNA與 1ml純化樹(shù)脂混勻后轉(zhuǎn)移至注射針管,加活塞輕推,同法用 2 ml 80%異丙醇洗滌 1次,14 000 r/min離心純化柱2min。加50μl預(yù)熱滅菌雙蒸水于純化柱 (65℃),室溫放置 1 min,13 000 r/min離心2 min,棄純化柱。加入 5μl新備的 3 mol/L NaOH,42℃水浴15 min,加入乙酸銨 (終濃度 3mol/L)、1μl糖原 (10 g/L)和三倍體積的無(wú)水乙醇,-20℃過(guò)夜。14 000 r/min 4℃離心20min,70%乙醇洗滌,加50μl雙蒸水溶解備用。

1.3.1 PCR 反應(yīng)體系為 25μl,每個(gè)反應(yīng)體系分別加入上述兩對(duì)引物;PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 4 min→94℃變性1 min→59.8℃退火 1 min→72℃延伸 1 min,進(jìn)行 33個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

1.3.2 電泳 基因擴(kuò)增后以 8μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上電泳,電流 45 mA,電壓 100 V,電泳載樣緩沖液為1×TBE緩沖液,電泳后,在紫外光透射儀上觀察,攝片并記錄結(jié)果。甲基化引物擴(kuò)增有 150 bp條帶說(shuō)明該基因發(fā)生了甲基化,非甲基化引物擴(kuò)增有 151 bp條帶則說(shuō)明該基因未發(fā)生甲基化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 長(zhǎng)壽組和對(duì)照組的各基因頻率比較分析用χ2檢驗(yàn),用 SPSS軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

LG組 p16基因甲基化率明顯低于 GC組(P＜0.05)。對(duì)男女分別比較后,LG組 p16基因甲基化率亦明顯低于 GC組(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 p16基因甲基化分布的長(zhǎng)壽組與對(duì)照組比較〔n(%)〕

3 討 論

抑癌基因與細(xì)胞衰老有著密切的關(guān)系,p16基因是目前研究較多的腫瘤抑制基因之一,其缺失與許多腫瘤有關(guān)〔6〕。p16屬于 INK 4a/ARP位點(diǎn)的腫瘤抑制基因,位于染色體 9p21,其編碼蛋白是 CDK4抑制物。近年研究表明 p16基因還與細(xì)胞衰老有著緊密聯(lián)系,p16的大量失活是誘發(fā)細(xì)胞衰老及腫瘤的一個(gè)重要原因之一。研究表明,p16的主要作用是特異地抑制細(xì)胞周期素 D-細(xì)胞周期素依賴(lài)性交合體對(duì)細(xì)胞 G1期到 S期的調(diào)控,當(dāng)其缺失或失活時(shí),交合體則持續(xù)高活性的存在于細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致 PRB基因的磷酸化,釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F等,激活多種細(xì)胞增殖的相關(guān)因子〔7〕,從而導(dǎo)致細(xì)胞 G1期到 S期的失控,細(xì)胞發(fā)生異常增殖,導(dǎo)致最后的惡變。

隨著研究的深入,人們認(rèn)識(shí)到基因的甲基化修飾同基因缺失、突變一樣,也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞衰老凋亡調(diào)節(jié)的重要因素。目前對(duì) DNA甲基化的研究還處在起步階段,DNA甲基化的發(fā)生原因及確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。甲基化是p16基因失活的重要機(jī)制,p16基因 5-CpG島甲基化已被證實(shí)與p 16的失活有密切的關(guān)系〔8〕。其機(jī)制可能與啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的 p16基因沉默有關(guān)。

廣西巴馬縣是著名的世界第五長(zhǎng)壽之鄉(xiāng),國(guó)內(nèi)很多學(xué)者對(duì)該地區(qū)的長(zhǎng)壽人群進(jìn)行了大量的研究〔9〕,但是關(guān)于遺傳因素方面的研究很少。本研究表明,長(zhǎng)壽組 p16基因甲基化比對(duì)照組低;對(duì)男女分別比較后,長(zhǎng)壽組 p16基因甲基化比對(duì)照組低。而兩組中女性 p16基因甲基化均比男性高,說(shuō)明不同性別人群p 16基因甲基化程度是不一樣的,研究衠明,長(zhǎng)壽與性別之間存在相關(guān)關(guān)系,人類(lèi)長(zhǎng)壽顯示明顯的母系遺傳傾向〔10〕。雖然女性的長(zhǎng)壽與其生理特點(diǎn)、社會(huì)生活習(xí)慣及生活環(huán)境等有很密切的關(guān)系,但是,不可否認(rèn)的是遺傳因素在其中也起了很重要的作用。本研究結(jié)果提示 p16基因甲基化和不同性別的長(zhǎng)壽人群有一定關(guān)系,可能正是由于長(zhǎng)壽老人 p16基因甲基化率低,使得p 16基因失活少,從而減少患癌癥等影響壽命的疾病的機(jī)會(huì)。由于遺傳因素在體內(nèi)的作用極其復(fù)雜,因此,要想弄清楚其在長(zhǎng)壽中的具體作用機(jī)制并非一朝一夕的事,仍然需要作更進(jìn)一步的研究。

p16基因甲基化與衰老的關(guān)系密切,對(duì)長(zhǎng)壽人群體內(nèi)這些基因的深入研究將有助于對(duì)抗衰老過(guò)程中抑制腫瘤發(fā)生的全面理解。另外,抗衰老過(guò)程中伴隨著抑制腫瘤的機(jī)制,因此,對(duì)細(xì)胞衰老的研究也將為癌癥的預(yù)防和治療方法研究提供更為廣闊的前景。

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