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    纈沙坦對(duì)擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

    2010-05-31 03:41:34張贏予張馨木蘇兆亮李衛(wèi)東尹春陽(yáng)陳建華張國(guó)輝
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2010年11期
    關(guān)鍵詞:阿霉素陽(yáng)性細(xì)胞心肌細(xì)胞

    張贏予 張馨木 蘇兆亮 李衛(wèi)東 尹春陽(yáng) 陳建華 張國(guó)輝

    (江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

    美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NIH)制訂的心血管疾病戰(zhàn)略,鼓勵(lì)從凋亡等方面,將心力衰竭和擴(kuò)張型心肌病(DCM)的分子細(xì)胞機(jī)制聯(lián)合研究〔1〕。血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)拮抗劑纈沙坦(Valsartan,Val)對(duì)于治療老年心力衰竭、自發(fā)性高血壓能夠有效抑制心肌細(xì)胞凋亡〔2~6〕,在心肌缺血再灌注損傷中也能減輕心肌細(xì)胞凋亡,減輕缺血再灌注損傷,保護(hù)心臟〔7〕。而 Val對(duì)于 DCM心肌細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。本研究通過(guò)觀察 Val對(duì)DCM心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,探討 Val降壓外的心臟保護(hù)作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠,8周齡,體重 220~260 g,由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào):SYXK(蘇)2008-0024〕。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 X-22R型冷凍離心機(jī)(美國(guó) Beckman公司),勻漿機(jī)(德國(guó) IKA公司),冰凍切片機(jī)、熒光倒置顯微鏡(德國(guó) Leica公司),垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。阿霉素(浙江海正藥業(yè)有限公司,批號(hào):070301),Val(北京諾華制藥有限公司,批號(hào):080401),氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司,批號(hào):HK071105)。試劑:考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號(hào) 20090511),甘露醇、蔗糖、琥珀酸(Sigma公司),Hepes(Amresco公司),EDTA(上海五聯(lián)化工廠),Tris(上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司)。

    1.3 動(dòng)物分組及處理 將 40只 SD大鼠完全隨機(jī)分為模型組(DCM組,n=15),Val干預(yù)組(DCM+Val組,n=15)和對(duì)照組(C組,n=10)。DCM組及 DCM+Val組給予阿霉素(2 mg/kg,1次/w)腹腔注射,C組給予相同體積生理鹽水腹腔注射。DCM+Val組每日給予Val(30 mg/kg)灌胃給藥,DCM組及 C組給予同體積生理鹽水灌胃,持續(xù)給藥 8 w。于第 8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)麻醉大鼠,采血后迅速取出心臟,一部分 4%中性甲醛固定,另一部分用生理鹽水制成 10%組織勻漿,測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

    1.4 Western印跡檢測(cè) VDAC、Smac蛋白的表達(dá) 采用 Western印跡檢測(cè)電壓依賴陰離子通道(voltage-dependent anion channels,VDAC)、第二個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)蛋白表達(dá)情況。步驟如下:提取各組大鼠心肌組織總蛋白,Bradford法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行 SDS-PAGE,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF膜,用含 5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過(guò)夜,TBST洗滌。一抗孵育過(guò)夜,洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,洗滌后用ECL plus顯色,Typon多功能激光掃描成像系統(tǒng)掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值,相對(duì)灰度值的計(jì)算為各蛋白與內(nèi)參 β-actin的比值,表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.5 免疫組化染色法檢測(cè)VDAC、Smac蛋白的表達(dá) 各組大鼠心肌組織固定 24 h,常規(guī)石蠟包埋、切片,厚度約 4~5μm,貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,采用免疫組化SP法檢測(cè)VDAC、Smac蛋白的表達(dá)。判定標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕褐色,著深棕色者為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,不著色者為陰性表達(dá)細(xì)胞,介于兩者之間者為弱陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

    1.6 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(cardiac myocyte apoptosis index,CMAI)的檢測(cè) 采用 Td T介導(dǎo)的 d UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)各組石蠟切片 CMAI,參照文獻(xiàn)方法〔8〕,按照試劑盒說(shuō)明書操作。200倍光鏡下觀察結(jié)果,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)視野中凋亡陽(yáng)性染色的心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù)的比例即 CMAI。判斷標(biāo)準(zhǔn):核藍(lán)染者為陰性細(xì)胞,即未發(fā)生凋亡的正常心肌細(xì)胞;胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。按公式計(jì)算:CMAI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù) ×100%。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),計(jì)量資料數(shù)據(jù)以 x±s表示,多組間均數(shù)比較采用 Student-Newman-Keuls法。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白表達(dá)的 Western印跡結(jié)果比較 DCM組和DCM+Val組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著高于 C組(均 P<0.05);但與DCM組相比,DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖 1。

    圖1 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白的表達(dá)

    2.2 各組大鼠心肌組織VDAC、Smac蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果比較 C組大鼠心肌組織中,大部分為胞漿藍(lán)染的陰性細(xì)胞,僅見(jiàn)少量的 VDAC、Smac陽(yáng)性細(xì)胞;DCM組和 DCM+Val組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于 C組,胞漿中可見(jiàn)大量的棕黃色顆粒;與 DCM組相比,DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著減少。見(jiàn)圖 2。

    圖2 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果(×200)

    2.3 各組大鼠心肌 CMAI的比較 與 C組相比,DCM組和DCM+Val組大鼠 CMAI顯著升高(P<0.05);與 DCM組相比,DCM+Val組大鼠CMAI有所降低,但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)圖 3,圖 4。

    圖3 各組大鼠心肌組織 TUNEL結(jié)果(×200)

    圖4 各組大鼠心肌CMAI的比較

    3 討 論

    心肌細(xì)胞凋亡廣泛存在于心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注和冠狀動(dòng)脈微栓塞中,是導(dǎo)致心血管疾病的重要原因〔9〕。細(xì)胞凋亡的兩條經(jīng)典通路為死亡受體通路(外源性通路)和線粒體通路(內(nèi)源性通路),其中線粒體凋亡通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。心肌組織是高耗能組織,線粒體的含量極其豐富,因此,線粒體凋亡通路在心肌凋亡中扮演著重要的角色。

    VDAC是存在于線粒體外膜上含量最豐富的膜蛋白,是細(xì)胞色素酶 C釋放通道外膜的組成成分,也是促凋亡和抗凋亡蛋白的瞄定點(diǎn),具有單通道傳導(dǎo)性、選擇性、電壓依賴性。其閉合可以抑制線粒體功能,導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變,使得細(xì)胞色素 C、Smac/Diablo、細(xì)胞凋亡因子等釋放,最終導(dǎo)致凋亡。VDAC受多種因素的影響,如缺氧、細(xì)胞低氧、乙醇、活性氧和活性氮、細(xì)胞因子、激酶、NADH的增加可以抑制 VDAC,促進(jìn)呼吸鏈底物如短鏈脂肪酸和乙醛氧化〔10~15〕。促凋亡線粒體蛋白Smac是細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)分子之一。在心肌組織中含量豐富,但是否參與了阿霉素?fù)p傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。大量研究表明,Smac在凋亡發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。正常情況下,Smac位于線粒體膜間隙。在細(xì)胞受到各種凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí),其線粒體定位信號(hào)肽被切除,形成有活性的蛋白,由線粒體釋放入胞質(zhì),特異結(jié)合凋亡抑制蛋白(IAPs),并解除其對(duì) caspases等的活性抑制作用,從而使 caspase-3、caspase-9活性增強(qiáng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn) Western印跡和免疫組化研究結(jié)果顯示,DCM組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac蛋白表達(dá)較 C組顯著升高,說(shuō)明這兩種蛋白參與了阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠的心肌凋亡過(guò)程,而DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白的表達(dá)較DCM組顯著下降,可能的機(jī)制為 Val通過(guò) AT1受體的作用,部分阻斷了心衰發(fā)生發(fā)展過(guò)程中 AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)測(cè)觀測(cè)到 Smac參與阿霉素心肌損傷后的病理生理改變,推測(cè)在損傷過(guò)程中 Smac可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑來(lái)介導(dǎo)心肌凋亡的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DCM+Val組大鼠CMAI較 DCM組有所降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其原因可能為在 DCM心肌細(xì)胞凋亡的晚期階段,心肌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了不可逆的變化,Val的干預(yù)只能部分減緩凋亡發(fā)生的進(jìn)程,而不足以阻止凋亡的發(fā)生。

    綜上所述,DCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,線粒體蛋白參與了心肌細(xì)胞的過(guò)度凋亡,進(jìn)而引起心肌組織的損傷。外源性給予 Val可以通過(guò)某些途徑抑制線粒體參與凋亡的蛋白的改變,進(jìn)而起到保護(hù)心臟的作用,但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究確定。而且,在DCM心衰發(fā)展的病理生理過(guò)程中,線粒體凋亡通路中是否還存在其他影響因素,尚需進(jìn)一步研究。

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