Smac/DIABLO與腫瘤治療的研究進(jìn)展

魏 巍 初 明 劉 爽

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨二科,黑龍江 佳木斯 154002)

靶向性治療一直是腫瘤治療的研究熱點(diǎn),腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)別主要在于:腫瘤細(xì)胞具有無限增殖,逃避凋亡,組織侵襲性以及轉(zhuǎn)移的能力。如何在治療過程中只殺死腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞是治療腫瘤的難點(diǎn)。Smac/NIABLO是 2000年首先由 Wang等〔1〕發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,命名為第 2個(gè)線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac),確定其位于線粒體中,在凋亡過程中與細(xì)胞色素 C一同由線粒體中釋放出來,與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。同年,Vaux等〔2〕也報(bào)道了這個(gè)蛋白,命名為低等電點(diǎn)凋亡抑制蛋白(IAPs)直接結(jié)合蛋白(direct IAP-binding protein with low pI,NIABLO)。經(jīng)過比對分析證實(shí)兩者為同一種蛋白,即命名為Smac/NIABLO蛋白。近年來,Smac/NIABLO只誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞的特點(diǎn)引起各國研究人員的注意,希望可以將其應(yīng)用于腫瘤靶向治療。

1 Smac/NIABLO蛋白的生物學(xué)特性

人類 Smac/DIABLO基因位于 12號(hào)染色體長臂,由 7個(gè)外顯 子 組 成。Smac/DIABLO有 Smac/DIABLO-L、Smac/DIA 2BLO-S和野生型 Smac/DIABLO 3種存在形式。Smac/DIABLO-L、S蛋白存在于線粒體內(nèi);而野生型的 Smac/DIABLO蛋白以純二聚體的形式存在于線粒體的膜間隙內(nèi)〔3,4〕。

Smac/NIABLO分子的 N端是由 55個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列,Smac/NIABLO前體在進(jìn)入線粒體后立即被水解去信號(hào)肽,只有水解后的Smac/NIABLO才具有活性。經(jīng) Western印跡實(shí)驗(yàn)測出有功能活性的Smac/NIABLO是 184個(gè)氨基酸殘基,分子量約 21 000〔3,4〕。在 2.2 A分辨率的 X線下,Smac/NIABLO單體是一個(gè)延伸的 3個(gè)螺旋多肽鏈組成的束狀結(jié)構(gòu),有中度彎曲,呈拱形。在生理緩沖液中,天然Smac/NIABLO呈二聚體狀態(tài)。單體型 Smac/NIABLO不能解除XIAP對 caspase的抑制作用。這說明 Smac/NIABLO二聚體狀態(tài)對其功能來說是必需的〔5,6〕。 2002年 GuoO等準(zhǔn)確定位 Smac/NIABLO的功能集團(tuán),即 N端前 5個(gè)殘基與其活性緊密相關(guān)〔7〕。用甲硫氨酸代替Smac/NIABLO其 N端的丙氨酸,則Smac/NIABLO完全不能與IAPs的BIR區(qū)域緊密結(jié)合而發(fā)揮其作用。當(dāng)Smac/NIABLO缺失其 N端的前 4個(gè)氨基酸殘基(A-V-P-I)時(shí),其與 IAPs的結(jié)合能力極度減弱?？梢?Smac/NIABLO的功能集團(tuán)主要位于 N端,C端輔助其與 IAPs結(jié)合緊密〔8〕。在抗腫瘤藥物的開發(fā)上,分子量小的蛋白在應(yīng)用上更加好操作,更少副作用,因此研究人員更加青睞 Smac/NIABLO蛋白的N端小肽。

2 Smac/NIABLO對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用

2.1 細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑 細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。一般認(rèn)為細(xì)胞凋亡分為受體凋亡途徑與線粒體凋亡途徑,包括 3個(gè)階段:誘導(dǎo)期(induction phase)、效應(yīng)期(effector phase)、降解期(degradation phase)。各種刺激經(jīng)相應(yīng)受體,通過效應(yīng)分子相互作用引起 caspase家族的級聯(lián)反應(yīng),降解細(xì)胞內(nèi)容物,隨之出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。其中 caspase酶的級聯(lián)反應(yīng)被視為大多數(shù)凋亡過程中細(xì)胞死亡效應(yīng)期的關(guān)鍵反應(yīng),因此控制 caspase的級聯(lián)反應(yīng)就是控制細(xì)胞凋亡的樞紐。雖然受體途徑與線粒體途徑所引發(fā)的 caspase級聯(lián)反應(yīng)途徑不同,但在某些水平是相互聯(lián)系的(如圖 1所示)。

圖1 細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)示意圖

2.2 Smac/NIABLO調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制 細(xì)胞凋亡每一步驟都受到嚴(yán)格精確的調(diào)控。Bcl-2蛋白家族可以激活 caspase酶原,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而凋亡抑制蛋白家族(IAPs)可以抑制caspase的級聯(lián)反應(yīng),從而阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程〔9〕。Smac/NIABLO可以與 IAPs家族成員 XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2、survivin等蛋白分子普遍反應(yīng),通過除去IAPs的抑制作用使caspase酶原活化,進(jìn)而達(dá)到促使細(xì)胞凋亡的作用。Smac/NIABLO能與IAP反應(yīng)是因?yàn)?IAP家族的所用成員都至少含有 1個(gè) BIR基序。實(shí)驗(yàn)表明,不同的BIR區(qū)域表現(xiàn)出不同的功能,在 Fas誘導(dǎo)的凋亡中,內(nèi)源性的 XIAP水解成為二部分,每一部分都有不同的caspase的特異識(shí)別位點(diǎn),XIAP的第二個(gè)BIR區(qū)域(BIR2)表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制凋亡的能力,而BIR1區(qū)域與BIR3區(qū)域卻未顯示出同樣活性〔10〕。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示 Smac/NIABLO可與 XIAP的 BIR2和 BIR3區(qū)域穩(wěn)定反應(yīng),而與 BIR1區(qū)域則無反應(yīng)。另外,BIR2、BIR3在與Smac/NIABLO結(jié)合過程中互相排斥,提示它們可能識(shí)別Smac/NIABLO的同源基序。BIR2可以抑制成熟caspase-3的催化活性,而 Smac/NIABLO與 BIR2區(qū)域結(jié)合可解除其抑制。在凋亡因子刺激下,位于細(xì)胞膜上的 caspase-8活化,但被XIAP阻滯,這需要Smac/NIABLO由線粒體中釋放來中和XIAP的作用,才允許 caspase-8直接激活效應(yīng)器,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔11〕。由此可見 Smac/DIABLO和 IAP是一種競爭性作用,因此可以通過增加Smac/DIABLO表達(dá)量實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。此外 Smac/DIABLO還具有其他機(jī)制來調(diào)節(jié)IAP功能。研究發(fā)現(xiàn),Smac/DIABLO可以選擇性地使 c2IAP1和 c2IAP2泛素化降解而導(dǎo)致兩者濃度降低〔12〕,這樣可以進(jìn)一步增加 Smac/DIABLO的相對濃度,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3 Smac/NIABLO在腫瘤治療中的應(yīng)用

3.1 Smac/NIABLO與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性 對于 Smac/NIABLO與腫瘤分期以及癌組織分型的相關(guān)性目前結(jié)論尚未統(tǒng)一。有的研究發(fā)現(xiàn) Smac/NIABLO在惡性程度高、低分化的腎細(xì)胞癌中蛋白表達(dá)水平明顯低于惡性程度低、高分化的腎細(xì)胞癌〔13〕,在肺癌的進(jìn)展過程中 Smac/NIABLO的表達(dá)水平降低。而有的研究則發(fā)現(xiàn) Smac/NIABLO蛋白表達(dá)水平與腫瘤分期及癌組織分型無關(guān),或者蛋白表達(dá)水平與 mRNA表達(dá)水平不一致。目前可以達(dá)成共識(shí)的是,Smac/NIABLO與XIAPs的比值在Ⅲ期腫瘤中明顯高于Ⅰ期與Ⅱ期腫瘤,在高轉(zhuǎn)移性腫瘤中明顯高于原位癌〔14〕。可見腫瘤進(jìn)展過程是一個(gè)復(fù)雜的多方面作用的綜合結(jié)果,其中Smac/NIABLO與 IAPs蛋白的比值在腫瘤細(xì)胞逃避凋亡、無限制的增殖過程中有重要意義。

3.2 Smac/NIABLO與腫瘤治療 自 2003年 Kashkar等〔15〕報(bào)道過表達(dá) Smac/NIABLO可以促使神經(jīng)母細(xì)胞瘤凋亡,這一發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了 Smac/NIABLO作為生物靶向分子,輔助抗腫瘤藥物的研究。例如,乳癌MCF-7細(xì)胞系屬于惡性度高、對誘導(dǎo)凋亡藥物不敏感的細(xì)胞,利用哺乳動(dòng)物 GFP-Smac/NIABLO表達(dá)系統(tǒng)使其在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) GFP-Smac/NIABLO融合蛋白,并轉(zhuǎn)變?yōu)閷λ劳鍪荏w敏感的細(xì)胞〔16〕。研究表明,過表達(dá) Smac/DIABLO可以使腫瘤細(xì)胞對凋亡刺激更加敏感。在種植肝癌細(xì)胞株的裸鼠模型,局部注射可以高表達(dá) Smac/NIABLO的腺病毒載體與 5-氟尿嘧啶,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡,瘤塊明顯縮小甚至消失〔17〕。尤其是Smac/NIABLO蛋白 N端分離下來的短氨基酸序列也可與 XIAP反應(yīng),作為 caspases的活化劑提高caspase-9、caspase-3的活化能力,一定濃度還可以殺傷 IAPs過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。Christina等〔18〕采用 Smac蛋白衍生的含有A-V-P-I氨基酸基序的小分子肽能增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和多種抗瘤藥物的治療效果。對不同腫瘤細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn),高表達(dá) Smac小肽可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性,但Smac/DIABLO并不誘導(dǎo)正常的細(xì)胞凋亡〔14〕。因此聯(lián)合 Smac小肽和抗癌藥物進(jìn)行腫瘤治療,一方面可以增加藥物效果,另一方面還可以減少藥物毒性。由此可見,Smac/DIABLO小肽分子作為抗腫瘤藥物的輔助劑與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 展 望

雖然目前在一些腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Smac/NIABLO蛋白表達(dá)水平與 mRNA表達(dá)水平不一致之類的問題尚未完全解決,但對于 Smac/NIABLO蛋白近 10年的研究過程中,將細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究工作向更深層次推進(jìn),令細(xì)胞凋亡機(jī)制的細(xì)節(jié)更完善;而且研究開發(fā)了 Smac/NIABLO蛋白對腫瘤臨床治療的應(yīng)用價(jià)值,使得在腫瘤的生物大分子治療方面有了重大突破。

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