HPLC檢測蜜炙甘草中主要成分含量的研究

伏秦超,王 鋼,趙 樂

(1.樂山師范學(xué)院峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所,四川樂山614004;2.樂山市人民醫(yī)院藥劑科,四川樂山6140004)

炙甘草(Radix Glycyrrhizae Preparata)是由生甘草加黃酒和蜜炮制得到的,具有多種藥理作用的中藥。生甘草補(bǔ)脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛,調(diào)和諸藥;蜜炙甘草補(bǔ)脾和胃,益氣復(fù)脈[1]。甘草中發(fā)揮藥理作用的主要成分為異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸等活性成分[2]。但目前關(guān)于蜜炙甘草和生用甘草中主要成分含量檢測的研究鮮見報道。本實驗采用高效液相色譜法,分別對蜜炙甘草和生用甘草中各主要藥理活性成分含量進(jìn)行檢測,以探究蜜炙與生用甘草藥理作用差異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津)配紫外檢測器;色譜柱:Shim-pack VP 18(150 mm×4.6 mm,5 μ m);FC204型電子分析天平(上海精科天平);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 生甘草為藥用飲片購自樂山市中藥材公司;蜜炙甘草按尹燕俠等[3]方法制備;98%異甘草素(批號:080921)、98%甘草苷(批號:081026)、99%甘草酸單銨鹽(批號:090317)、99%甘草次酸(批號:090319),均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;乙醇、冰醋酸、醋酸銨、磷酸、濃鹽酸、氯仿等均為國產(chǎn)分析純,乙腈、甲醇為國產(chǎn)HPLC色譜純,所有化試藥物均0.22 μ m濾膜過濾;水為自制重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制 將異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸分別按表1所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 g/L

2.2 待檢溶液的制備 異甘草素和甘草苷:稱取生甘草和蜜炙甘草各0.02 g,分別溶于10 mL 50%乙醇中,80℃水浴20 min,超聲提取 10 min,過濾,濾液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾,即得異甘草素、甘草苷待檢溶液。甘草酸單銨:稱取生甘草和蜜炙甘草各0.5 g,分別置于不同三角瓶中,加入40 mL蒸餾水,煮沸,再沸水浴 20 min,超聲提取 10 min,過濾 ,濾液經(jīng) 0.22 μ m微孔濾膜過濾,即得甘草酸單銨待檢溶液。甘草次酸:稱取生甘草和蜜炙甘草各0.2 g,分別置于不同三角瓶中,加入濃鹽酸5 mL,再加入氯仿20 mL,超聲提取2次,每次10 min,合并氯仿液,過濾。濾液蒸干,加入10 mL甲醇溶解,經(jīng) 0.22 μ m微孔濾膜過濾,即得甘草次酸待檢溶液。

2.3 色譜條件 通過試驗,確定高效液相色譜檢測儀的最佳工作條件,具體的參數(shù)如表2所示。異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽、甘草次酸色譜圖分別見圖1～圖4。

2.3.1 異甘草素 圖1所示依次為異甘草素標(biāo)準(zhǔn)品、待檢溶液檢測結(jié)果。

圖1 異甘草素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC圖

2.3.2 甘草苷 圖2所示依次為甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品、待檢溶液檢測結(jié)果。

圖2 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC圖

2.3.3 甘草酸單銨鹽 圖3所示依次為甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品、待檢溶液檢測結(jié)果。

圖3 甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC圖

2.3.4 甘草次酸 圖4所示依次為甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品、待檢溶液檢測結(jié)果。

圖4 甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC圖

表2 儀器工作條件

2.4 方法的專屬性考察 在上述的色譜條件下,將對照品溶液、供試品溶液、甘草陰性對照溶液注入液相色譜儀中,得HPLC圖(以異甘草素為例,結(jié)果見圖5),結(jié)果顯示陰性對照無干擾。

圖5 對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察 通過對平均峰面積Y對進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸,分別列出了各主要成分含量的線性方程。結(jié)果見表3。

表3 回歸方程 μ g

2.6 樣品測定 將2.2項下待檢溶液進(jìn)行測定并計算各成分的含量,結(jié)果顯示,蜜炙對甘草中甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的含量影響極顯著,見表4。

2.7 精密度試驗 精密移取對照品10.0 μ L,連續(xù)進(jìn)樣5次,測定峰面積,得異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸峰面積的 RSD分別為1.02%、0.96%、1.05%和1.10%。

2.8 重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一樣品5份,依法測定。結(jié)果顯示:異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的平均含量分別為 0.0239%、0.2756%、1.6477%和2.3479%,RSD分別為1.10%、1.04%、1.01%和1.06%。表明重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率試驗 按2.2項制備樣品溶液的方法精密稱取適量的已測知含量的任一樣品各5份,制備不同的樣品溶液,分別加入已知量的相應(yīng)的對照品溶液。按照2.3項下的色譜條件測定。計算異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的回收率。結(jié)果顯示異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的平均回收率分別為98.0%、98.8%、98.9%和99.6%。結(jié)果見表5。

表4 蜜炙甘草中各成分含量測定結(jié)果(±s,n=3) %

表4 蜜炙甘草中各成分含量測定結(jié)果(±s,n=3) %

注:與生甘草比較,##P＜0.01。

組 別 異甘草素 甘草苷 甘草酸單銨鹽 甘草次酸生 甘 草 0.0251±0.0003 0.4105±0.0041 2.0981±0.0227 3.8862±0.0378蜜炙甘草 0.0237±0.0001 0.2776±0.0024## 1.6355±0.0157## 2.3342±0.0223##

表5 加樣回收率試驗結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 甘草入藥已有悠久歷史,早在二千多年前,《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其列為藥之上乘。南朝醫(yī)學(xué)家陶弘景將甘草尊為“國老”[4]。甘草性平味甘,生則微寒,能清熱解毒,潤肺祛痰;炙則微溫,能益氣生津,緩和藥性,緩急定痛。甘草配伍藥方臨床上被用于慢性胃炎[5]、慢性腰肌勞損[6]、慢性咽痛和夜尿頻多[7]的治療?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究證明,甘草中的異甘草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[8],甘草苷具有抗抑郁作用[9],甘草酸和甘草次酸具有抗炎、抗?jié)?、抗病毒、降血脂、防治腫瘤、促進(jìn)胰島素吸收等多方面作用[10]。但是,臨床上大量使用生甘草時常伴有類醛固酮增多癥,其特征是鈉潴留、鉀排泄量增加,引起水腫、高血壓、低血鉀等一系列的副作用[11]。從本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示:在同樣的處理條件下,與生甘草相比,蜜炙甘草中甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的含量降低了28.2%、17.2%和36.2%,異甘草素含量幾乎無差異。因此,從上可推導(dǎo)出,蜜炙甘草較生甘草功能發(fā)生改變的主要原因是甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸等主要成分的含量變化所致。

3.2 蜜炙甘草是經(jīng)蜜、酒和水浸潤后文火炒至六、七成干而炙成的,其中加蜜的目的是除去雜質(zhì)、部分水分和殺滅微生物,加酒有助于蜜的滲透作用和有效成分的溶出。從以上實驗結(jié)果分析,由于異甘草素和甘草次酸是脂溶性物質(zhì),故水煎很難溶出。因此,該類脂溶性藥物的藥理作用活性和蜜炙甘草中加蜜和酒的作用還有待考究。

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