正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選骨刺寧膏乙醇滲漉提取工藝

（佛山市中醫(yī)院制劑中心，廣東佛山528000）

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選骨刺寧膏乙醇滲漉提取工藝

霍燕嫻

（佛山市中醫(yī)院制劑中心，廣東佛山528000）

目的優(yōu)選骨刺寧膏的乙醇滲漉提取工藝條件。方法以丹皮酚的提取量為考察指標(biāo)，用高效液相色譜法測定丹皮酚含量，以乙醇濃度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度為考察因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果最佳提取工藝為：藥材加10倍量的90%（w）的乙醇浸泡36 h，以2 mL／（min／kg）速度滲漉提取。結(jié)論該提取工藝所得丹皮酚含量較高，而干膏率較低，且簡便易行，穩(wěn)定性好。

骨刺寧膏；正交設(shè)計(jì)；提取工藝；丹皮酚；高效液相色譜法

骨刺寧膏是由徐長卿、川芎、當(dāng)歸、威靈仙、紅花等11味中藥組成，具有祛風(fēng)通絡(luò)，活血止痛的功效。經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，對頸椎、腰椎、四肢關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生引起的酸脹、麻木、疼痛等癥有很好的療效。原臨床使用是將藥材粉碎為細(xì)粉制成散劑，用蜂蜜或水調(diào)勻成糊狀敷貼患處。為了提高療效和方便使用，現(xiàn)將其改革為橡膠貼膏劑型。進(jìn)行工藝研究過程中，考慮到有效成分的最大提取和減少雜質(zhì)提取量，采用了乙醇滲漉提取方法。對滲漉提取工藝進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)，以乙醇濃度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度為影響因素，以徐長卿中有效成分丹皮酚提取量為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定丹皮酚含量，試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀（G1311A四元梯度泵，G1313A自動進(jìn)樣器，G1314A可變波長紫外檢測器，G1379A真空脫氣泵，G1316A柱溫箱，G2170A色譜工作站）；METTLE AE 240電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；BUG25-06超聲波發(fā)生器（功率250 W，頻率25 kHz；上海必能信超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥丹皮酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110708-200505）；徐長卿對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：121514-200501）；其它藥材均購于佛山市醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 滲漉提取工藝設(shè)計(jì)采用L9（34）正交試驗(yàn)，設(shè)置乙醇濃度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度4個(gè)因素，每個(gè)因素進(jìn)行三水平考察，以徐長卿中有效成分丹皮酚提取量及干膏收率為評價(jià)指標(biāo)，見表1。

表1 因素水平表

2.2 色譜條件色譜柱為Hypersil ODS2 C18（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（45∶55）；［1］流速為1.0 mL／min；檢測波長為274 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL。

2.3 對照品溶液的制備精密稱取丹皮酚對照品1.8 mg，用甲醇溶解并稀釋成0.18 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備按處方比例精密稱取各藥材粗粉共約50 g，其中徐長卿藥材約6 g，共9份，分別按表1正交設(shè)計(jì)方案提取，根據(jù)不同提取量各吸取適量，揮干溶劑后用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，即得。

2.5 陰性樣品溶液的制備按比例稱取不含徐長卿的其余藥材用70%乙醇滲漉提取，按供試品溶液制法制備，即得。

2.6 干擾試驗(yàn)分別吸取丹皮酚對照品溶液、5號供試品溶液、缺徐長卿的陰性樣品溶液各10μL按上述色譜條件進(jìn)樣，檢測，可見丹皮酚對照品、供試品在14 min左右出現(xiàn)丹皮酚特征吸收峰，且與其它組分峰分離較完全，徐長卿陰性對照溶液無干擾。

2.7 線性關(guān)系考察分別精密吸取丹皮酚對照品溶液4，8，12，16，20，24μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖并以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值（mv／s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y＝23 980.76X＋1 446.82（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，丹皮酚在0.72～4.32μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 回收率試驗(yàn)精密量取3號樣品滲漉液10 mL，共6份，分為3組，分別加入丹皮酚對照品溶液適量，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓⒍ㄈ萦?0 mL量瓶中，即得加樣回收供試液，取10μL進(jìn)樣，按上述方法檢測，計(jì)算回收率為98.06%，RSD為1.25%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)精密量取3號樣品滲漉液，共5份，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下測定，結(jié)果丹皮酚平均含量為1.62%，RSD為1.6%。2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，按丹皮酚峰面積計(jì)算，RSD為0.82%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.11 正交試驗(yàn)結(jié)果將1～9號樣品滲漉液各取一半，水浴濃縮，并減壓干燥成干浸膏，稱重，計(jì)算干膏得率；精密吸取1～9號供試品溶液各10μL，進(jìn)樣測定，計(jì)算丹皮酚含量，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3，4。

表2 正交設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果

表3 丹皮酚含量方差分析

表4 干膏得率方差分析

從表2直觀分析，影響丹皮酚提取量和干膏得率的因素的大小順序分別為：A＞C＞D＞B，A＞B＞C＞D。表3，表4方差分析表明：乙醇濃度對丹皮酚提取量和干膏得率均有顯著性影響，此外，浸泡時(shí)間對丹皮酚提取量也有顯著性影響；而乙醇用量對干膏得率也有顯著性影響，表明：乙醇含水量高，使用量大，所提取的浸膏量也多。綜合考慮，確定優(yōu)選工藝為A3B1C3D1，即用10倍量的90%（w）的乙醇浸泡36 h，以2 mL（min／kg）速度滲漉提取，此工藝提取的丹皮酚含量高，而浸膏得率低，適合貼膏劑的制備。重復(fù)性試驗(yàn)與此一致。

2.12 驗(yàn)證試驗(yàn)按處方比例稱取徐長卿等藥材50 g，共3份，用優(yōu)選工藝提取，分別稱定，計(jì)算干膏得率，測定丹皮酚含量。3批藥材所測干膏率分別為9.26%，9.17%，9.33%，丹皮酚提取量分別為1.52%，1.54%，1.51%。測定所用藥材徐長卿中丹皮酚含量為1.56%，符合《中國藥典》2005年版一部中徐長卿藥材中按干品計(jì)算，含丹皮酚不得少于1.3%的規(guī)定［2］。經(jīng)計(jì)算，優(yōu)選提取工藝所得丹皮酚的平均轉(zhuǎn)移率達(dá)97.6%。

3 討論

3.1 外用散劑由于使用不便，患者操作麻煩，且有效成分從藥材細(xì)胞中釋放率低，皮膚吸收相對較慢，故改為貼膏劑型，使用方便，療效顯著提高。并通過正交試驗(yàn)比較了徐長卿的乙醇滲漉工藝、回流工藝和水蒸氣蒸餾提取工藝，結(jié)果表明滲漉法最優(yōu)。

3.2 丹皮酚測定試驗(yàn)中曾比較甲醇-水、乙腈-水二種流動相，以乙腈-水為流動相所得色譜峰形好、分離效果較優(yōu)，并試驗(yàn)過流動相乙腈-水不同配比（70∶30）、（65∶35）、（60∶40）、（55∶45）、（50∶50）、（45∶55）、（40∶60）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以本文選擇的流動相乙腈-水（45∶55）的分離效果最好。

［1］湛文青，李華.HPLC法測定徐長卿中丹皮酚的含量［J］.中藥材，2004，27（2）：104.

［2］國家藥典委員會.中國藥典一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：200.

R282.2

A

1007－4813（2010）04－0593－02

2010－06－20）