注射用磷酸肌酸鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

王宗春,羅麗萍,周延安,宋金春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

0 引 言

注射用磷酸肌酸鈉是一種化學(xué)藥制劑,原料藥化學(xué)名為N-[亞胺基(膦氨基)-甲基]-N-甲基甘氨酸二鈉鹽四水合物,臨床主要用于缺血狀態(tài)下的心肌代謝異常,也可用于心臟手術(shù)時(shí)加入心臟停搏液中保護(hù)心肌等.采用鱟試劑方法檢測(cè)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn),已被各國(guó)藥典所采用.筆者參照中國(guó)藥典2010年版(二部)[1]以及《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2005 年版[2],應(yīng)用鱟試劑方法對(duì)注射用磷酸肌酸鈉進(jìn)行了研究,為該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法的建立提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

SW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司)；微量取液器(50～250 μL)(上海金林生化試劑儀器廠)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠).

1.2 藥品與試劑

注射用磷酸肌酸鈉(?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?批號(hào)：20090802,20100213,20100422,規(guī)格0.5 g)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠,批號(hào)：090816,每支10 mL)；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)生物制品檢定所,批號(hào)：2009-7,每支10 EU)；鱟試劑(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠,批號(hào)：091149,靈敏度：0.5 EU/mL)； 鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)：090325,靈敏度：0.5 EU/mL).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解,在旋渦混合器上混勻15 min,然后稀釋成2.0,1.0,0.5,0.25λ(靈敏度標(biāo)示值)4個(gè)內(nèi)毒素單位濃度等級(jí),依法[1]進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn).

1.3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定[1,3]按照注射用磷酸肌酸鈉說(shuō)明書(shū),本品臨床每次用量為1 g,在30～45 min內(nèi)靜脈滴注,故人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量M=1 000/(50×1)=20 mg/(kg·h)(輸液時(shí)間不足1 h 按1 h計(jì)算,人平均體重按50 kg計(jì)算),靜脈注射劑的每千克體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量K為5 EU/(kg·h),因此本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M=0.25 EU/mg.

1.3.3 樣品最小有效稀釋濃度(C)的確定 樣品有效稀釋濃度C=λ/L,其中λ為鱟試劑常用靈敏度,L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值,即0.25 EU/mg,目前市售的鱟試劑λ常為 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/mL,對(duì)應(yīng)的樣品最小有效稀釋質(zhì)量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL.

1.3.4 干擾預(yù)試驗(yàn) 用BET水將注射用磷酸肌酸鈉稀釋成濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的系列溶液,作為供試品陰性對(duì)照(NPC)系列.另制備同樣濃度的供試品系列溶液,使每一濃度的供試品溶液中都含有2λ內(nèi)毒素,作為供試品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)系列.每一供試品濃度重復(fù)兩管,按常規(guī)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(PC)管和陰性對(duì)照(NC)管[4-5].用λ為0.5 EU/mL的鱟試劑與上述NPC和PPC系列溶液進(jìn)行反應(yīng).將反應(yīng)管中溶液輕輕混勻后,封閉管口,垂直放入(37±1) ℃恒溫水浴箱中,保溫(60±2) min,將反應(yīng)管輕輕取出,緩緩倒轉(zhuǎn)180 °,觀察結(jié)果,若管內(nèi)形成凝膠,并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性.

1.3.5 干擾試驗(yàn) 根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,用質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的注射用磷酸肌酸鈉溶液及BET水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,配成細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度為1.0,0.5,0.25,0.125 EU/mL的系列溶液,分別取0.1 mL加入到已復(fù)溶的兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(λ為0.5 EU/mL)管內(nèi),每個(gè)濃度平行做4管,另取供試品溶液做2支陰性對(duì)照(NC)管,同法進(jìn)行供試品干擾試驗(yàn).

1.3.6 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 取3批注射用磷酸肌酸鈉(每批各取5支),用BET水配成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的溶液,使用λ為0.5 Eu/mL的鱟試劑,按中國(guó)藥典2010年版(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作.

2 結(jié)果和討論

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

由于鱟試劑是一種生物制品,靈敏度常有變異.另外,貯存條件、出廠時(shí)間的不同有時(shí)也會(huì)影響靈敏度[6],因此,在進(jìn)行干擾試驗(yàn)前需進(jìn)行靈敏度復(fù)核.表1結(jié)果顯示靈敏度測(cè)定值λc均在0.5～2.0λ之間,說(shuō)明兩個(gè)不同鱟試劑生產(chǎn)廠家出廠的鱟試劑其靈敏度符合要求,可用于實(shí)驗(yàn).

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.2 干擾預(yù)試驗(yàn)

為了初步評(píng)價(jià)樣品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì),以便篩選出對(duì)檢查無(wú)干擾的樣品濃度范圍及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度,避免鱟試劑的浪費(fèi)[4-5].本研究首先用BET水將注射用磷酸肌酸鈉配制成濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的系列溶液,依法[1]進(jìn)行干擾試驗(yàn).

表2 注射用磷酸肌酸鈉干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2結(jié)果顯示,濃度為2.0～0.125 mg/mL的供試品溶液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)既無(wú)抑制作用,也無(wú)增強(qiáng)作用.

2.3 干擾試驗(yàn)

根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇濃度為2.0 mg/mL的注射用磷酸肌酸鈉溶液和λ為0.5 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn).表3為干擾試驗(yàn)結(jié)果,可以看出當(dāng)注射用磷酸肌酸鈉的濃度為2.0 mg/mL時(shí),Es(用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值)在0.5～2.0λ之間,且Et在0.5～2.0 Es(用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值)范圍內(nèi),故認(rèn)為濃度為2.0 mg/mL的供試品溶液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)不產(chǎn)生干擾.

表3 注射用磷酸肌酸鈉干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

將3批注射用磷酸肌酸鈉配成濃度為2.0 mg/mL的溶液,用靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,結(jié)果全部呈陰性,說(shuō)明3批注射用磷酸肌酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的限值均符合規(guī)定.

3 結(jié) 語(yǔ)

注射劑質(zhì)量控制中,常采用家兔法控制熱原(細(xì)菌內(nèi)毒素),但是該法存在操作復(fù)雜、影響因素多且費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn).鱟試劑方法具有操作簡(jiǎn)單、迅速且靈敏度高的特點(diǎn).本研究采用兩個(gè)不同廠家的鱟試劑(消除不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑在配方、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面存在差異的影響),對(duì)3個(gè)批號(hào)的注射用磷酸肌酸鈉溶液(配制成濃度為2.0 mg/mL)進(jìn)行干擾試驗(yàn),干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示Es 在0.5～2.0λ之間,且Et在0.5～2.0 Es范圍內(nèi),按照中國(guó)藥典2010版(二部)干擾試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn),濃度為2.0 mg/mL的注射用磷酸肌酸鈉溶液不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的凝集反應(yīng).因此,使用鱟試劑方法檢測(cè)注射用磷酸肌酸鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的,能夠用于該品種的內(nèi)毒素檢測(cè).

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