rhBNP對(duì)急性心肌梗死再灌注后急性期細(xì)胞因子、心肌凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

崔麗杰，李占全，袁 龍，張薇薇，趙鴻梅，彭妍鈺

（遼寧省人民醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧沈陽 110016）

腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是由 32個(gè)氨基酸殘基組成的17環(huán)狀多肽，BNP通過與其受體結(jié)合，從而介導(dǎo)一系列生理學(xué)效應(yīng)，上述生理學(xué)作用可以明顯改善心功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過敲除BNP基因，心房肽（ANP）或BNP或其相應(yīng)受體受到破壞，可以導(dǎo)致血壓上升和（或）心肌纖維化的發(fā)生；BNP通過改善腎臟功能或通過神經(jīng)激素的作用，降低心室內(nèi)壓力和緩解失代償性心力衰竭患者的呼吸困難。重組人腦利鈉鈦（rhBNP），國(guó)外商品名為奈西利肽，已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為急性失代償性心力衰竭治療的一線用藥，它的另一個(gè)治療應(yīng)用前景為心肌梗死后的早期治療。有個(gè)案報(bào)道急性心肌梗死（AMI）后應(yīng)用重組人ANP對(duì)左室重構(gòu)有利[1]，但對(duì)于心肌梗死后階段早期應(yīng)用奈西利肽少有報(bào)道。本研究旨在觀察AMI再灌注后早期應(yīng)用rhBNP對(duì)急性期細(xì)胞因子及心肌凋亡的影響，為尋求新的治療AMI的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雌性雜種犬15只，體重12～20 kg，購(gòu)自中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 AMI再灌注模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 術(shù)前禁食8 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，將犬仰臥固定于操作臺(tái)上，右股動(dòng)脈穿刺置入6F動(dòng)脈鞘管，穿刺對(duì)側(cè)股靜脈置入6F鞘管備補(bǔ)液及搶救用藥。經(jīng)股動(dòng)脈彈丸式注入肝素鈉2 500 U，每隔1 h左右追加肝素鈉1 250 U。冠脈指引導(dǎo)管行冠脈造影，后置入PTCA導(dǎo)絲，在導(dǎo)絲指引下置入（2.0～2.5）mm×（9～15）mm的人PTCA球囊至左前降支（LAD）或左旋支（LCX）中段以下，球囊經(jīng)缺血預(yù)適應(yīng)3～4次，打開球囊，造影顯示球囊遠(yuǎn)端血流中斷。90 min后撤除球囊，重新造影示封堵冠脈血流再通。保留左冠脈guilding指引導(dǎo)管，備冠脈取血及冠脈內(nèi)用藥。術(shù)中1只犬麻醉過量，2只犬出現(xiàn)室顫死亡；其余12只犬模型制作成功。實(shí)驗(yàn)犬隨機(jī)分為rhBNP組和對(duì)照組。rhBNP組以凍干rhBNP（商品名新活素，0.5 mg/支；西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20050033）以0.9 μg/kg冠脈注射＞3min；后以 0.06 μg/（kg·min）靜脈滴注 60 min。 對(duì)照組以等體積生理鹽水作同期對(duì)照。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 術(shù)前及球囊封堵后90、210 min股靜脈采血5 ml，球囊封堵后90 min于左冠脈采血5 ml，置于加有1.5 mg/ml乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中，室溫下1 000 g離心15 min后取血漿1.5 ml置于指形試管中，將所有標(biāo)本置于-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)量血漿BNP、ET-1水平。嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.3 梗死邊緣心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) PTCA術(shù)后210 min應(yīng)用10%氯化鉀注射液15～20 ml靜推處死動(dòng)物，于心尖部沿短軸方向剖開心臟，沿心臟短軸將心臟切為橫斷組織塊（厚度約2 mm），在梗死邊緣心肌取材，置于10%中性甲醛固定液中固定24 h，組織包埋后石蠟切片，原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞含量（AI）。嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)采用多因數(shù)方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)及成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料

兩組犬在體重、梗死相關(guān)動(dòng)脈及冠脈優(yōu)勢(shì)情況方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組血漿BNP水平比較

見表1。

表1 兩組血漿BNP水平比較（x±s，pg/ml）

2.3 兩組血漿ET-1水平比較

見表2。

表2 兩組血漿ET-1水平比較（x±s，pg/ml）

2.4 兩組凋亡心肌比較

rhBNP組凋亡陽性細(xì)胞指數(shù)為（17.5±2.9）%，對(duì)照組為（24.5±3.6）%，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

心肌在較長(zhǎng)時(shí)間缺血造成一定損傷后，恢復(fù)供血不但不減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而加重?fù)p傷，這種現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷。在缺血-再灌注過程中，內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激合成并釋放ET-1，后者有很強(qiáng)的縮血管作用，導(dǎo)致血管增殖，加重心室和血管的纖維化，同時(shí)也是其他神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)的強(qiáng)化因子，并參與調(diào)節(jié)BNP合成和釋放[2-3]。因此，本研究以AMI再灌注血清學(xué)水平觀察血漿BNP、ET-1水平的變化，探討應(yīng)用rhBNP對(duì)心臟的保護(hù)作用。本研究顯示，對(duì)照組犬在球囊封堵后90 min血漿ET-1水平有所升高，再灌注2 h后的血漿ET-1水平明顯升高，提示再灌注后ET-1合成和釋放增多，這與Tonnessen等[4]的報(bào)道一致，犬在球囊封堵90 min后血漿BNP水平有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示BNP未能與ET-1相平衡，這符合既往結(jié)論[5]；210 min后血漿BNP水平則顯著升高，提示可能出現(xiàn)心功能不全，這也符合心衰犬的BNP可信區(qū)間[6]。冠脈血漿BNP和ET-1水平高于術(shù)前外周血相應(yīng)因子水平，提示冠脈內(nèi)細(xì)胞因子變化更明顯，缺血早期心肌內(nèi)啟動(dòng)了自我調(diào)節(jié)機(jī)制，是一個(gè)對(duì)急性組織損傷的急性期反應(yīng)；且也為缺血-再灌注后即刻冠脈應(yīng)用rhBNP提供時(shí)間依據(jù)。rhBNP組術(shù)后210 min外周血BNP及ET-1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示外源性應(yīng)用rhBNP可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，減少缺血-再灌注損傷。

心肌缺血-再灌注可致冠狀血管及心肌受損，ANP及BNP孵化的人類中性粒細(xì)胞能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，并減弱其介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞毒性作用。在冠脈再灌注治療中應(yīng)用低劑量利鈉肽，能夠限制短暫性冠狀動(dòng)脈阻塞所致的心肌細(xì)胞死亡[7]。Fiscus等[8]采用原位末端標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺血-再灌注大鼠心肌細(xì)胞中有典型的凋亡形態(tài)改變，認(rèn)為細(xì)胞凋亡是缺血-再灌注損傷的特征之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rhBNP組凋亡心肌數(shù)量顯著低于對(duì)照組，提示應(yīng)用rhBNP可減少凋亡，對(duì)心臟有保護(hù)作用，這也與有關(guān)報(bào)道相符。

綜上所述，AMI再灌注早期應(yīng)用rhBNP可減少梗死后再灌注損傷，但由于本實(shí)驗(yàn)的樣本有限，在今后的研究中需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量，為臨床AMI患者觀察再灌注損傷提供參考。

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