山楂中熊果酸和齊墩果酸的高效液相色譜分析

周巧霞， 顧振綸

（1.蘇州九龍醫(yī)院藥劑科，江蘇蘇州 215021;2.蘇州中藥研究所，江蘇 蘇州 215007）

山楂為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥果實(shí)，具有消食健胃.行氣散瘀作用。用于肉食積滯，胃腕脹滿，瘀血經(jīng)閉，高脂血癥［1］。現(xiàn)代藥理研究表明熊果酸和齊墩果酸是山楂降血脂的主要活性成分，且含量較高［2］。熊果酸和齊墩果酸為一對(duì)異構(gòu)體，含量測(cè)定多采用高效液相色譜法［3，4］，但在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兩組分分離效果不好且拖尾因子過(guò)大。本文建立的反相高效液相色譜法很好的解決了這兩點(diǎn)，并對(duì)3個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters510高效液相色譜儀（WDL－95色譜工作站，Waters484紫外檢測(cè)器，Waters7725i進(jìn)樣閥）;Sartorius BS110S電子天平（萬(wàn)分之一）;PHS－3C型精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠）。二蒸水;四丁基氫氧化銨、磷酸鹽等均為分析純;甲醇為色譜純。熊果酸和齊墩果酸含量測(cè)定用對(duì)照品（0742－9909和 110709－200505）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;山楂提取物為本所自制。

1.2 樣品制備

對(duì)照品溶液:取熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品約12 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液:取山楂提取物約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3 色譜條件 分析柱采用μBandapakTMC18柱，300 mm×3.9 mm ID，10 μm粒徑（美國(guó)Waters公司）;流動(dòng)相為pH3.5的甲醇/磷酸鹽緩沖液（85/15含0.4%四丁基氫氧化銨），波長(zhǎng)215 nm，流速1.0 mL/min，柱溫:40℃。

2 結(jié)果

2.1 pH的影響 分別配制pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸鹽緩沖液/甲醇為50/50的流動(dòng)相，按上述分析方法分離樣品溶液。結(jié)果表明:pH在3.5時(shí)熊果酸和齊墩果酸的峰形和分離度較好;pH升高，峰形變窄、保留時(shí)間縮短，但熊果酸與齊墩果酸部分重疊;pH降低，峰形變寬、保留時(shí)間延長(zhǎng)。故選擇pH為3.5左右。

2.2 四丁基氫氧化銨的影響 分別配制含四丁基氫氧化銨為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%（v/v）的流動(dòng)相，按上述方法分析樣品溶液。結(jié)果表明:四丁基氫氧化銨濃度由0.2%增加到0.4%時(shí)，峰形變窄、拖尾因子變小;由0.4%增加到0.6%、0.8%時(shí)，峰形和拖尾因子無(wú)明顯變化。故選用四丁基氫氧化銨濃度為0.4%。

2.3 甲醇濃度的影響 配制甲醇/磷酸鹽緩沖液不同比例的流動(dòng)相，按上述方法分析樣品溶液。結(jié)果表明:甲醇比例在85%時(shí)，既保持了良好的峰形、分離度和拖尾因子，又有合適的分析時(shí)間，故選擇甲醇/磷酸鹽緩沖液為85/15。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL分別注入高效液相色譜儀測(cè)定峰面積，以質(zhì)量對(duì)峰面積回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。熊果酸:Y=51 024X+996 0（r=0.999 8），線性范圍為0.82～4.1 μg;齊墩果酸:Y=48 839X+6 932（r=0.999 9），線性范圍為0.80 ～4.0 μg。

2.5 精密度 用以上色譜條件將對(duì)照品溶液和樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，熊果酸的RSD為0.57%，齊墩果酸的RSD為0.52%。

2.6 重現(xiàn)性 制備供試品溶液5份，各吸取5 μL進(jìn)樣分析，計(jì)算含量。熊果酸的RSD為0.75%，齊墩果酸的RSD為0.68%。

2.7 穩(wěn)定性 取供試品溶液分別于配制后0、1、3、5、21、23、25 h依法測(cè)定，熊果酸的RSD為1.45%，齊墩果酸的RSD為1.25%。

2.8 回收率 采用加樣回收（n=5），精密稱取已知含量山楂提取物10 mg，精密加入熊果酸對(duì)照品液10 mL和齊墩果酸對(duì)照品液3 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按以上色譜條件測(cè)定，計(jì)算。熊果酸的平均回收率:98.52%，RSD 1.47%;齊墩果酸的平均回收率:98.13%，RSD 1.61%。

2.9 樣品分析 取三批山楂提取物，按供試品溶液制備項(xiàng)下配制，測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1和圖2。

表1 山楂提取物中熊果酸和齊墩果酸含量測(cè)定

圖1 對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 山楂提取物HPLC圖譜

3 討論

拖尾因子是高效液相色譜定量分析時(shí)非常重要的一個(gè)影響因素，特別是在相鄰兩峰靠得比較近得時(shí)候，直接關(guān)系定量的準(zhǔn)確性。本文方法在建立時(shí)嘗試了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸鹽緩沖液、乙腈－磷酸鹽緩沖液等多個(gè)流動(dòng)相，甲醇－磷酸鹽緩沖液體系表現(xiàn)出了較好的分離度和峰形，但拖尾因子仍較大。為了解決這一問(wèn)題，嘗試了在甲醇－磷酸鹽緩沖液體系中加三乙胺和四丁基氫氧化銨。三乙胺的加入對(duì)峰形和拖尾因子沒(méi)有明顯影響，但四丁基氫氧化銨加入后，熊果酸和齊墩果酸的峰形明顯變窄、拖尾因子變小?？赡艿脑蚴撬亩』鶜溲趸@加入后與兩種成分結(jié)合生成離子對(duì)，改善了在C18色譜柱上的保留。

在反相柱上甲醇的比例增減對(duì)熊果酸和齊墩果酸的保留和分離度有影響。選擇的流動(dòng)相體系既要使兩組分能與眾多雜質(zhì)分離，又要保證有合適的分析時(shí)間。

經(jīng)全波長(zhǎng)紫外－可見(jiàn)掃描，熊果酸和齊墩果酸的最大吸收波長(zhǎng)為207 nm;由于甲醇在此波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的末端吸收，為了減少干擾又盡量不降低靈敏度，確定在215 nm波長(zhǎng)測(cè)定熊果酸和齊墩果酸含量。

本法應(yīng)用時(shí)，應(yīng)注意pH值的穩(wěn)定，過(guò)高或過(guò)低都將影響色譜峰的分離度、峰形和拖尾因子，建議將pH值穩(wěn)定在3.5。流動(dòng)相長(zhǎng)時(shí)間放置再使用會(huì)導(dǎo)致組分保留時(shí)間延長(zhǎng)，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

經(jīng)不同品牌的C18色譜柱測(cè)試，方法的重現(xiàn)性較好。本法曾用于不同產(chǎn)地山楂提取物的含量測(cè)定，色譜峰的分離度、峰形和拖尾因子均較好。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:22－22.

［2］陰 健，郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用［M］.北京:學(xué)苑出版社，1993:101－108.

［3］白雪梅，付煜榮，田嘉銘.高效液相色譜法測(cè)定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（8）:981－982.

［4］黃秋妹，李 宗.HPLC法測(cè)定山楂中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］. 海峽藥學(xué)，2007，19（3）:43－45.