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    β-欖香烯抑制人骨髓瘤細(xì)胞增殖

    2010-05-26 06:14:34王素云楊敬慈
    中成藥 2010年5期
    關(guān)鍵詞:香烯細(xì)胞核骨髓瘤

    陳 浩, 師 亮, 王素云, 楊敬慈, 潘 崚*

    (1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科,石家莊 050000;2.山西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室,太原 030001)

    多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤,目前尚缺乏有效治療手段,故尋找新的治療方法尤為必要[1]。β-欖香烯(β-elemene)是具有抗腫瘤功效的中藥溫莪術(shù)的有效提取物[2]。但對骨髓瘤影響如何,目前尚不清楚。本研究采用不同濃度β-欖香烯處理體外培養(yǎng)的人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞,觀察β-欖香烯對骨髓瘤細(xì)胞增殖、周期、凋亡等影響,以期為欖香烯用于對骨髓瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)生物科技總公司提供。在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素 120 μg/mL 的 RPMI-1640中37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),生長曲線測試倍增時間為(24±1)h,1~2 d傳代1次。所有實驗均在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行。

    1.2 藥品與試劑 β-欖香烯購自大連金港制藥有限公司,使用前溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中,配成1 000 μmol/L母液,超濾除菌,-20℃保存。碘化丙啶(PI)、噻唑藍(lán)(MTT)購自 Sigma公司。Annexin V/PI雙染試劑盒購于南京凱基生物公司。Hoechst33342/PI雙染試劑盒購于河北渤海生物公司。

    1.3 細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測。將處于對數(shù)生長期的RPMI-8226細(xì)胞(2×105/mL)接種于96孔板,每孔 200 μL。加入終濃度分別為 10、20、40、80 μmol/L的 β-欖香烯處理,對照組加入等體積的DMSO,每組各設(shè)4個平行孔;分別于藥物作用后24、48 和72 h 時,每孔加入5 g/L MTT 20 μL,繼續(xù)孵育4 h,離心去除上清后各加入DMSO 200 μL,輕微振蕩使結(jié)晶溶解后,以酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值,計算增殖抑制率。

    增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%

    1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 按Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒操作流程,不同濃度β-欖香烯作用48 h后收集細(xì)胞,PBS充分洗滌,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取400 μL細(xì)胞懸液,加入5 μL 的 Annexin V-FITC,混勻,室溫避光孵育10 min,離心去上清,重懸細(xì)胞后加入 PI使其終濃度為1 μg/mL,避光作用后上機(jī)檢測細(xì)胞周期(FACScaliber,美國BD公司)。同法,另取細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡。

    1.5 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡觀察 不同濃度β-欖香烯作用48 h后收集細(xì)胞,PBS充分洗滌。1 000 r/min離心棄上清,1 mL培養(yǎng)液重懸,避光加入 10 μL Hoechst 33342,混勻,37℃ 孵育 8 min,PBS沖洗3次去除Hoechst33342,再加入終濃度為5 μg/mL PI染液,避光染色5 min,轉(zhuǎn)移至載玻片,熒光顯微鏡下分別于350 nm及488 nm激發(fā)熒光,200倍鏡下觀察(正常細(xì)胞細(xì)胞核為暗藍(lán)色;早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈亮藍(lán)色;中期、晚期凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈淡紅色或深紅色;)。

    2 結(jié)果

    2.1 β-欖香烯對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞體外生長的影響 β-欖香烯隨著濃度增加和作用時間延長,對細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng),呈濃度、時間依賴性;(表1)。

    表1 β-欖香烯對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖的抑制作用(±s,n=4)Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line(RPMI-8226)

    表1 β-欖香烯對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖的抑制作用(±s,n=4)Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line(RPMI-8226)

    與0 μmol/L 組比較,P <0.01。

    β-欖香烯/(μmol/L)24 h吸光度 抑制率/%48 h吸光度 抑制率/%72 h吸光度 抑制率/%0 0.216 7±0.024 1 0.531 5±0.010 4 0.822 2±0.0441.075 6±0.014 6 90.81 10 0.169 5±0.013 9 21.79 0.332±0.006 2 37.54 0.455 8±0.005 7 44.56 20 0.147 2±0.003 1 32.06 0.227±0.013 4 57.33 0.285 1±0.011 8 65.32 40 0.122 6±0.012 1 43.42 0.145 7±0.015 6 72.58 0.133 7±0.014 2 83.74 80 0.102 6±0.002 3 52.64 0.126 8±0.010 4 76.14 0

    2.2 β-欖香烯對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞周期的影響 數(shù)據(jù)顯示:各藥物處理組G0/G1細(xì)胞比例較對照組顯著增加;G2/M、S期細(xì)胞比例較對照組減少(表2)。

    2.3 β-欖香烯對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞凋亡的影響 隨β-欖香烯濃度的增加,藥物組骨髓瘤細(xì)胞凋亡率遞增(表3)。

    表2 β-欖香烯作用48 h后對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞周期的影響(±s,n=4)Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line(RPMI 8226)

    表2 β-欖香烯作用48 h后對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞周期的影響(±s,n=4)Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line(RPMI 8226)

    與0 μmol/L組比較,*P <0.05,**P<0.01。

    β-欖香烯(μmol/L)各期細(xì)胞所占比例G0/G1 S G2/M 0 47.87±5.67 37.72±3.81 14.41±2.26 10 54.68±4.03** 33.96±2.04* 11.36±1.79*20 60.11±5.78** 30.15±2.42* 8.63±1.05**40 65.26±6.36** 27.84±1.89** 4.94±1.32**80 71.33±5.81** 25.21±2.01** 2.46±0.98**

    表3 β-欖香烯作用48 h后對骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞凋亡的影響(ˉx ± s,n=4)Tab.3 Infuence of β-elemene on apoptosis rate of human multiple myolema cell line(RPMI-8226)in 48 h

    2.4 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡觀察 對照組鏡下可見大量暗藍(lán)色正常骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞。10、20 μmol/L β-欖香烯處理組鏡下可見典型凋亡細(xì)胞,以早期凋亡細(xì)胞為主,細(xì)胞核呈亮藍(lán)色,染色質(zhì)凝集,或核呈分葉、碎片狀邊集。40、80 μmol/L β-欖香烯處理組鏡下可見大量凋亡細(xì)胞,中期、晚期凋亡細(xì)胞增多,細(xì)胞核呈淡紅色或深紅色,染色質(zhì)片段化凝集呈多個亮點;還可見少量體積增大、核溶解、深紅色或亮紅色的細(xì)胞。

    3 討論

    β-欖香烯是抗腫瘤中藥溫莪術(shù)的有效提取物[2]。鑒于此,本研究首先通過 MTT實驗觀察β-欖香烯對骨髓瘤細(xì)胞體外生長的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度β-欖香烯對骨髓瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用,且呈濃度和時間依賴性。提示β-欖香烯可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。

    本研究結(jié)果還表明β-欖香烯可阻滯骨髓瘤細(xì)胞生長周期,激活細(xì)胞凋亡通路,還可能啟動細(xì)胞“凋亡”機(jī)制[3],導(dǎo)致體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制,有望成為新的骨髓瘤臨床治療藥物。

    [1]Dmoszynska A.Diagnosis and the current trends in multiple myeloma therapy[J].Pol Arch Med Wewn,2008,118:563-6.

    [2]Peng X,Zhao Y,Liang X,et al.Assessing the quality of RCTs on the effect of beta-elemene,one ingredient of a Chinese herb,against malignant tumors[J].Contemp Clin Trials,2006,27:70-82.

    [3]Van Cruchten S,Van Den Broeck W.Morphological and biochemical aspects of apoptosis,oncosis and necrosis[J].Anat Histol Embryol,2002,31:214-23.

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