我國市場蜂蜜真實性現(xiàn)狀及判別指標研究

陳 芳 黃京平 王 鵬 張金振 趙 靜 李 熠

（中國農(nóng)科院蜜蜂研究所，國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂業(yè)分中心，北京100093）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)過在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水、貯存至成熟的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜因具有較高的營養(yǎng)價值深受人們喜愛。近年來，隨著人民生活水平的提高和保健意識的增強，國內(nèi)消費市場也在日益增大，蜂蜜真實性已成為政府重視、社會關(guān)注和人民關(guān)心的熱點問題，也是困擾行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題。

行業(yè)自律是維護蜂蜜真實性的根本之道，但與時俱進的國家標準及檢測技術(shù)是保障蜂蜜真實性的不可或缺的有力砝碼。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局頒布的《蜂蜜中碳-4植物糖含量測定方法穩(wěn)定碳同位素比率法》(GB/T18932.1-2002)和2005年頒布的強制性國家標準《蜂蜜》（GB18796-2005），對保障蜂蜜真實性和維護蜂產(chǎn)品行業(yè)及市場秩序都產(chǎn)生了積極的作用。但隨著造假技術(shù)的不斷深入，單一的檢測技術(shù)及評判指標已不適應(yīng)維護蜂蜜真實性的需求，需要認真地調(diào)查我國市場蜂蜜產(chǎn)品的現(xiàn)狀，分析研究各項基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以提供科學有效的應(yīng)對技術(shù)。

本研究從全國17個主要蜂蜜產(chǎn)區(qū)的代表城市抽取相當數(shù)量的蜂蜜樣品，通過液相色譜、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜等先進的儀器分析蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖（以下簡稱蜂蜜四糖）及碳同位素比值。描述分析數(shù)據(jù)的基本情況及可能的真實性現(xiàn)狀，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，包括描述性分析、獨立樣本T檢驗及因子分析（主成分分析）等，提煉出更為科學合理的真實性評價指標。

2 材料與方法

以下方法均采用國家標準GB/T18932.1-2002[2],GB/T18932.22-2003[3]。

2.1 材料與試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標準品購于美國Sigma公司。橄欖油標準品購于英國Elemental Microanalysis公司。乙腈（色譜級），鎢酸鈉、硫酸均為優(yōu)級純。流動相用水為超純水，樣品前處理用水為去離子水。

2.2 儀器與設(shè)備

Waters2695液相色譜儀，2414示差檢測器；SerCon EA-Hydra20-20穩(wěn)定同位素比例色譜儀；Milli-Q超純水儀；恒溫水浴鍋；高速離心機。

2.3 樣品的采集

330個蜂蜜樣品采自十幾個省、市、自治區(qū)的市場或超市，具體情況如下：安徽?。?9個）、北京市（79個）、福建省（8個）、廣東?。?0個）、廣西壯族自治區(qū)（17個）、河北?。?1個）、河南?。?0個）、湖北?。?3個）、江蘇?。?6個）、江西?。?3個）、遼寧?。?9個）、山東?。?9個）、上海市（32個）、四川?。?1個）、天津市（7個）、浙江省（26個）。

2.4 試劑及標線配制

2.4.1 果糖、葡萄糖標準儲備溶液：準確稱取5g果糖標準物質(zhì)和4g葡萄糖標準物質(zhì)，精確至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

2.4.2 蔗糖、麥芽糖標準儲備溶液：分別稱取2g蔗糖和2g麥芽糖標準物質(zhì)，精確至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

2.4.3 標準曲線的繪制：吸取不同體積的果糖、葡萄糖標準儲備溶液和蔗糖、麥芽糖標準儲備溶液，用乙腈+水（40+60）稀釋至體積，配成不同濃度的蜂蜜四糖標準工作溶液，用于繪制標準工作曲線。如下表：

表1 繪制標準工作曲線用的標準溶液濃度、用量

2.4.4 10%鎢酸鈉溶液：稱取10g鎢酸鈉，用水定容至100ml。

2.4.5 0.335mol/l硫酸溶液：移取9.4ml硫酸，用水定容至 500ml。

2.4.6 取1.0μl橄欖油標準品于8mm×5mm錫杯中，密封用于測定蛋白質(zhì)樣品；取2.0μl橄欖油標準品于8mm×5mm錫杯中，密封用于測定蜂蜜樣品。

2.5 樣品的制備

2.5.1 蜂蜜四糖樣品的制備：稱取5 g試樣，精確至0.001g。置于100 ml燒杯中，加入30 ml水，用玻璃棒攪拌使試樣完全溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，然后再用3×10ml水洗燒杯并轉(zhuǎn)移至上述100ml容量瓶中，用乙腈定容至體積，混勻。用0.45μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中，用液相色譜-示差折光檢測器測定。

2.5.2 蜂蜜中C-4植物糖樣品的制備：稱取蜂蜜樣品10～12g于50ml離心管中，加入4ml水混勻，在一支20ml量筒中加入2.0ml10%鎢酸鈉溶液和2.0ml0.336mol/l硫酸溶液，迅速混勻后，加到上述盛蜂蜜樣品的離心管中，混勻。置于80℃水浴中加熱不少于30min，在加熱過程中，每隔5～10min旋轉(zhuǎn)混合離心管中內(nèi)容物20s，直到有絮狀物析出。

以水注滿離心管并混合，在RCF1500×g下離心5min，傾掉上層清液，再以約50ml水充分洗滌沉淀物并離心，如此反復洗滌沉淀物5次，最后刀桿上清液，將含有沉淀蛋白質(zhì)的離心管置于75℃烘箱中干燥3h以上,備用。

稱取上述烘干的蛋白質(zhì)3.0mg，于8mm×5mm錫杯中，密封備用；移取3.0μl蜂蜜樣品于8mm×5mm錫杯中，密封備用；蛋白質(zhì)及蜂蜜樣品均制備平行樣。

2.6 儀器參數(shù)及樣品測定

2.6.1 液相色譜條件：色譜柱：色譜柱為Carbohydrate(250mm×4μm×4.6 i.d)或相當者；流動相：乙腈+水（77+23）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測器池溫度：35℃；進樣量：15 μl。

2.6.2 穩(wěn)定同位素比例色譜儀條件：載氣：氦氣（99.999%）；助燃氣：氧氣（99.999%）；燃燒爐溫度：1000℃；反應(yīng)爐：600℃；色譜柱溫度：70℃。

2.7 數(shù)據(jù)分析

蜂蜜四糖及C-4植物糖均參見國家標準中的結(jié)果計算方法計算結(jié)果。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，包括描述性分析、獨立樣本T檢驗、因子分析（主成分分析）等。

3 結(jié)果與討論

3.1 市場蜂蜜真實性現(xiàn)狀

以國家標準中規(guī)定的果糖、葡萄糖之和（即還原糖含量）大于60%，蔗糖含量低于5%，C-4植物糖含量小于或等于7%為合格計，共有83個樣品不合格，其中18個是還原糖含量和C-4植物糖均不合格，6個還原糖含量不合格，但C-4植物糖含量卻合格，59個還原糖含量合格但C-4植物糖不合格，無蔗糖不合格樣品。

由此可推見我國目前蜂蜜市場現(xiàn)狀大致可歸納為以下幾點：1.產(chǎn)品合格率低，僅為74.8%；C-4植物糖不合格是蜂蜜樣品不合格的主要表現(xiàn)形式，C-4不合格率占總不合格樣品的92.8%。2.還原糖不合格的樣品僅為很小一部分，無蔗糖不合格樣品。3.市場的不合格樣品中以摻假居多，完全造假行為（即以無蛋白析出樣品計）較少，僅占總樣品量的1.81%。4.市場出現(xiàn)了很大一部分以非C-4植物糖為原料的摻假蜂蜜，現(xiàn)有的國家標準無法約束。目前我國現(xiàn)行的國家標準是用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法測定蜂蜜中C-4植物糖含量，因此只能計算出添加的C-4植物糖含量，不能約束非C-4植物糖的添加物。而國際通用的ISCIRA指數(shù)是指δ13CH與δ13CP的差值的絕對值小于1，表明的是純天然蜂蜜δ13CH與δ13CP的離散程度，可以在一定程度上對非蜂蜜添加物進行約束。因此以ISCIRA指數(shù)計，不合格數(shù)為132個，且這132個不合格樣品中涵蓋了所有還原糖不合格樣品。由此可見，ISCIRA指數(shù)對目前我國蜂蜜市場上出現(xiàn)了很大一部分非C-4植物糖摻假的蜂蜜樣品，具有一定的約束力。

3.2 蜂蜜樣品產(chǎn)品指標的統(tǒng)計分析

雖然，目前我們已經(jīng)運用了先進的儀器設(shè)備和檢測技術(shù)對蜂蜜質(zhì)量進行監(jiān)管，但由于巨大的商業(yè)潛力及造假技術(shù)的不斷深入，單一的檢測技術(shù)及判定指標很難對蜂蜜真實性進行鑒別，因此我們應(yīng)該提取更多的判定指標，對蜂蜜的真實性進行更為嚴格的限定，以保障蜂蜜市場的有序。根據(jù)上述現(xiàn)狀，以果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、還原糖、果葡比、δ13CH、δ13CP、ISCIRA 指數(shù)等 9 個指標為統(tǒng)計對象，重點研究不合格與合格樣品各項指標的差異及合格樣品可能的代表性指標。探索性描述分析結(jié)果表明（見圖1），合格樣品組較不合格樣品組具有各個指標的分布范圍更集中，且符合更好的正態(tài)分布模型等特征。獨立樣本T檢驗發(fā)現(xiàn)，果糖、葡萄糖、麥芽糖、δ13CH值和δ13CP值組間平均值差異顯著，蔗糖組間均值差異不顯著。合格組的果糖、葡萄糖平均值顯著高于不合格組，麥芽糖、δ13CH、δ13CP值顯著低于不合格組均值，合格組δ13CH、δ13CP均值分別為-24.14‰和-24.16‰，低于-23.5‰（目前認為的摻假界限[4]），而不合格組 δ13CH、δ13CP的均值分別為-22.20‰和-22.84‰，高于-23.5‰。

圖1 合格樣品與不合格樣品8項指標正態(tài)分布圖差異比較

對合格樣品及不合格樣品的因子分析得出的統(tǒng)計模型（圖2）發(fā)現(xiàn)，不合格樣品提取出了3個公因子，分別為還原糖含量、ISCIRA指數(shù)及C-4植物糖含量。代表了用于描述不合格蜂蜜樣品性狀的指標僅為糖的含量、蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度和C-4植物糖含量?，F(xiàn)行國家標準中對蜂蜜中還原糖含量及C-4植物糖含量已經(jīng)有了標準限定，但這兩項指標對目前市場上出現(xiàn)的非C-4植物糖型的摻假行為不具備約束力，統(tǒng)計模型中第二公因子ISCIRA指數(shù)的提出證明了ISCIRA值更利于描述蜂蜜真實性，因為ISCIRA指數(shù)所表達的意義已經(jīng)涵蓋并延伸了現(xiàn)行國家標準中C-4植物糖含量的規(guī)定。合格樣品提取出了4個公因子，分別為果葡比、還原糖含量、ISCIRA指數(shù)和δ13CP值，說明了用于描述合格樣品性狀的指標應(yīng)包括蜂蜜中糖的構(gòu)成、糖的含量、蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度及蜂蜜蛋白值的同位素比值。在合格樣品和不合格樣品中均有提取到公因子還原糖含量和ISCIRA指數(shù)，但合格樣品多了果葡比和δ13CP值，其中δ13CP值因其穩(wěn)定及檢測效果好而被認定為蜂蜜碳同位素比值測定法的內(nèi)標物[5]。也就是說，即使糖的含量和蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度符合標準要求，也不一定表明是真實的蜂蜜樣品，還應(yīng)該對不同品種蜂蜜的果葡比及δ13CP值進行深入的研究，給出合理的范圍，才有利于蜂蜜真實性及品質(zhì)鑒別。

圖2 合格樣品(A)與不合格樣品(B)因子分析成分得分系數(shù)矩陣圖

4 展望

由于我國蜜源植物豐富，且地域遼闊，氣候、環(huán)境條件差異十分顯著，因此，不同地區(qū)、不同品種的蜂蜜樣品的糖的含量、構(gòu)成及δ13CP值將會有很大的差異。在未來的研究中，我們應(yīng)深入細致地調(diào)查蜂蜜品種、地域在糖的含量、構(gòu)成，δ13CP值和ISCIRA指數(shù)等指標上的差異，給出合理的范圍值，細化標準，為蜂蜜質(zhì)量與品質(zhì)監(jiān)督檢驗提供技術(shù)支持。

［1］中華人民共和國國標GB18796－2005.

［2］中華人民共和國國標《蜂蜜中碳-4植物糖含量測定方法穩(wěn)定碳同位素比率法》GB/T18932.1－2002.

［3］中華人民共和國國家標準《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖測定方法液相色譜法》GB/T18932.22-2003.

［4］朱青，王畢妮，梁艷，陳衛(wèi)軍，曹煒.蜂蜜摻假檢測方法的研究進展[J].中國蜂業(yè) 2008，59（10）：35-37.

［5］胡福良.碳穩(wěn)定同位素比值分析法(SIRA)在蜂蜜質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用[J].中國養(yǎng)蜂 2000，51（6）：21-22.