腎病綜合征大鼠腎組織中腫瘤壞死因子α的變化及霉酚酸酯對(duì)其影響

韓丹，姜紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽(yáng) 110001）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PSN）是最為常見的小兒腎小球疾病之一。腎病綜合征的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，近年研究證明，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factar-α，TNF-α）可能參與PSN發(fā)病［1］，監(jiān)測(cè)血清TNF-α水平有助于判定病情和預(yù)后［2］。然而目前有關(guān)PSN腎臟組織中TNF-α變化的報(bào)道很少。PSN治療雖然仍以糖皮質(zhì)激素為主，并使大部分患者得以緩解，但復(fù)發(fā)、頻復(fù)發(fā)、激素依賴、激素耐藥等問題仍然是臨床治療的難題。霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種新型免疫抑制劑，近年已逐漸用于難治性腎病的治療，并被證實(shí)安全有效［3，4］，但是 MMF 治療 PSN 的機(jī)制仍不十分清楚。

本研究通過構(gòu)建大鼠腎病綜合征模型，討論腎組織中TNF-α與PSN的關(guān)系，觀察MMF對(duì)大鼠腎病綜合征的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、腎臟組織學(xué)及腎組織中TNF-α變化的影響，為MMF用于人類PSN的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：健康雄性純種Wistar大鼠36只，SPF清潔級(jí)，周齡 6～8周，體質(zhì)量 170～210 g，購(gòu)至中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 用藥及試劑：鹽酸阿霉素（意大利法瑪西亞普強(qiáng)公司）、霉酚酸酯（上海羅氏制藥有限公司）、腫瘤壞死因子α免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法：將36只Wistar大鼠隨機(jī)分3組：腎病綜合征組（A組）、酶酚酸酯干預(yù)組（B組）、正常對(duì)照組（C組），每組各12只。其中A、B均制成腎病綜合征模型，B組從實(shí)驗(yàn)第1天給予MMF干預(yù)，劑量按20 mg/kg，每日1次，灌胃，共28 d，A組、C組從第1天給予0.4 ml生理鹽水，每日1次，灌胃，共 28 d。

1.2.2 腎病綜合征模型的建立：于實(shí)驗(yàn)第1天，A組和B組按Bertain方法［5］制作腎病綜合征模型，即非麻醉下一次性尾靜脈注阿霉素（6.5 mg/kg），C組同法注射等量生理鹽水。

1.2.3 觀察指標(biāo)：將大鼠于實(shí)驗(yàn) 1、7、14、21、28 d 置于代謝籠中，收集24 h尿液，測(cè)24 h尿蛋白定量。各實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)14、21、28 d分別處死4只，取出雙腎，切成小塊以2.5%戊二醛或4%多聚甲醛固定，以備切片進(jìn)行光鏡、TNF-α免疫組化檢測(cè)及電鏡檢查。

1.2.4 免疫組化結(jié)果的判定：細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著染的為陽(yáng)性細(xì)胞。TNF-α表達(dá)的強(qiáng)度用MetaMorph offline圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，每張切片在高倍（×400）下測(cè)定5個(gè)視野的平均積分光密度值（integral optical density，IOD），取其平均值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以x±s表示，利用SPSS13.0軟件,采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 24 h尿蛋白定量

實(shí)驗(yàn)14 d之后，A組和B組大鼠24 h尿蛋白定量顯著高于C組（P<0.01），造模成功；A組24 h尿蛋白定量逐漸增多；B組24 h尿蛋白定量均顯著低于A組（P<0.01），實(shí)驗(yàn)21 h達(dá)高峰，28 d與21 d相比明顯下降。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量水平的比較（x±s）Tab.1 24-hour urine protein quantity of each group（x ±s）

2.2 光鏡

實(shí)驗(yàn)28 d各組腎小球和腎小管均未見明顯變化。本實(shí)驗(yàn)A、B組光鏡表現(xiàn)符合微小病變型腎病。見圖1。

2.3 電鏡

實(shí)驗(yàn)28 d，A組大鼠腎臟均出現(xiàn)腎小球上皮細(xì)胞腫脹、空泡形成、廣泛足突融合；而B組大鼠腎臟也出現(xiàn)腎小球上皮細(xì)胞腫脹、空泡形成，但僅部分足突出現(xiàn)融合；C組腎小球上皮細(xì)胞正常。見圖2。

2.4 免疫組化

TNF-α主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞胞質(zhì)中，腎小球細(xì)胞胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。在實(shí)驗(yàn) 14、21、28 d，A 組大鼠腎臟中 TNF-α 的表達(dá)均顯著強(qiáng)于B組、C組（P<0.01），并隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行表達(dá)顯著增加；而B組TNF-α的表達(dá)均弱于A組（P<0.01），強(qiáng)于 C 組（P<0.01），并在實(shí)驗(yàn) 21 d達(dá)高峰；C組TNF-α在腎臟組織中表達(dá)較少，各個(gè)時(shí)期強(qiáng)度不變。見表2，圖3。

表2 各組大鼠腎組織中TNF-α表達(dá)的IOD的變化（x±s）Tab.2 The average integrate OD value changes of TNF-α in rat renal tissues（x ±s）

3 討論

小兒PNS發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)認(rèn)為與淋巴細(xì)胞功能紊亂有關(guān)，炎性細(xì)胞因子在腎病綜合征的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［6］。TNF-α 主要由激活的單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，腎臟固有細(xì)胞，如系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞也能產(chǎn)生。TNF-α具有多向性生物活性，可造成炎性損傷［7］，TNF-α 可促進(jìn)許多分子的表達(dá)，如IL-8等，這些生物分子會(huì)使系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。

本研究通過構(gòu)建大鼠腎病綜合征模型，討論腎組織中TNF-α與原發(fā)性腎病綜合征發(fā)病的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中A組TNF-α在腎臟組織中隨著病程表達(dá)逐漸增多，與C組相比表達(dá)顯著增強(qiáng)。說明了腎組織中TNF-α可能參與原發(fā)性腎病綜合征發(fā)病。

糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒性藥物雖然可使大部分患者得以緩解，但由于對(duì)人體細(xì)胞的選擇性差，在抑制異常的免疫反應(yīng)同時(shí)，也抑制人體其他細(xì)胞的正常功能，因此毒副作用大。MMF是一種新型免疫抑制劑，其特點(diǎn)是選擇性地抑制鳥嘌呤的經(jīng)典合成途徑［8］，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制具有高度的選擇性，而對(duì)肝細(xì)胞、骨骼細(xì)胞等其他細(xì)胞無影響，MMF已逐漸用于難治性腎病的治療。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MMF可緩解原發(fā)性腎病綜合征病情。實(shí)驗(yàn)中B組TNF-α在腎臟組織中表達(dá)弱于A組，略強(qiáng)于C組，并隨干預(yù)的進(jìn)行在實(shí)驗(yàn)21 d后減弱。說明了MMF治療腎病綜合征的機(jī)制可能與腎組織中TNF-α水平的減少有關(guān)。

綜上所述，大鼠腎病綜合征模型腎組織中的TNF-α增高。MMF可能通過降低腎組織中TNF-α的增高，減少蛋白尿，減輕腎組織的損傷。

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