超聲介導(dǎo)微泡對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞一氧化氮及一氧化氮合酶活性的影響

魏紅，童嘉毅，范國峰，馮毅，李鵬

（1.東南大學(xué)醫(yī)院，南京 210018；2.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，南京 2100092；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008）

急性心肌梗死是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的臨床常見病。藥物治療和血運(yùn)重建技術(shù)的不斷發(fā)展，使急性心肌梗死的死亡率明顯降低，但對(duì)心肌梗死后心力衰竭仍無有效的治療手段。近年來，許多臨床研究提示干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病，能夠改善心肌功能，但治療效果仍不肯定，甚至相互矛盾。本課題組初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲介導(dǎo)微泡能夠增加豬骨髓單個(gè)核干細(xì)胞歸巢至局部梗死心肌的能力，遠(yuǎn)期心功能得到明顯改善［1，2］，并且對(duì)移植干細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期無不良影響［3］。然而，超聲介導(dǎo)微泡增強(qiáng)移植干細(xì)胞靶向歸巢的機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)觀察超聲介導(dǎo)微泡對(duì)內(nèi)皮組細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs） 生成一氧化氮（nitric oxide，NO）的量及一氧化氮合酶（nitrogen synthase，NOS）活性的影響，以了解其增效干細(xì)胞治療的機(jī)制，從而進(jìn)一步指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和臨床研究。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和設(shè)備

淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque（天津?yàn)笊锕荆?，培養(yǎng)液 EGM-2（Cambrex），纖維連接蛋白（Fn，Chemicon）；Di I標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍祝―i I-acLDL，Molecular Probe），F(xiàn)ITC 標(biāo)記荊 豆 凝集 素 I（FITC-UEA-I，Sigma），硝酸還原酶法測定NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），NOS分型測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），含氟碳?xì)怏w脂質(zhì)體微泡（東南大學(xué)生物工程材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），熒光正立顯微鏡（Nicon），CZT-3超聲同步治療儀（沈陽新樂康復(fù)醫(yī)療儀器廠），3722N型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定

于雄性豬（2月齡中國家豬，東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）脛骨近端抽取骨髓約20 ml，加入Ficoll-Paque分離液，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，以3×105/ml的密度，接種于鋪有Fn的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液用EGM-2。培養(yǎng)至7 d行DiLacLDL和FITC-UEA-I雙染色，記數(shù)雙陽性細(xì)胞為EPCs。

1.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞的分組和干預(yù)

培養(yǎng)細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、超聲組和超聲微泡組。實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)的EPCs用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，搖勻后以100μl（約5×105/ml）加入96孔培養(yǎng)板。對(duì)照組不做干預(yù)，超聲組以頻率1 MHz，輸出功率1W/cm2，持續(xù)輻照90 s；超聲微泡組加入5μl微泡（約 2×108/ml），以同樣超聲條件作用 90 s。96 孔培養(yǎng)板固定在37℃雙蒸水水槽表面，超聲探頭垂直置于培養(yǎng)板下方約8 cm處，為避免超聲波對(duì)鄰近孔細(xì)胞的影響，隔孔接種細(xì)胞，每組8孔。干預(yù)后分別收集細(xì)胞和上清液。

1．4 內(nèi)皮祖細(xì)胞生成NO和NOS活力測定

應(yīng)用NO試劑盒通過硝酸還原酶法檢測EPCs上清液NO含量；應(yīng)用NOS分型測定試劑盒測定EPCs細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student Newman Keuls（S-NK）檢驗(yàn)，P﹤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定結(jié)果

培養(yǎng)7 d，貼壁細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，可見圓形及不規(guī)則形細(xì)胞。熒光顯微鏡下，細(xì)胞攝取DiLac LDL后呈紅色，F(xiàn)ITC-UEA-I染色后呈綠色，雙染色細(xì)胞的EPCs占90%以上（圖1）。

2．2 超聲聯(lián)合微泡對(duì)EPCs生成NO的影響

硝酸還原酶法檢測EPCs干預(yù)后的上清液，結(jié)果表明：超聲組為（70.43±9.52）μmol/L，與對(duì)照組（72.85±9.08）μmol/L無顯著性差異；超聲微泡組為（88.70±8.78）μmol/L，與對(duì)照組和超聲組均有顯著性增加（P<0.05）。

2．3 超聲聯(lián)合微泡對(duì)EPCs各型NOS活力的影響

對(duì)照組、超聲組和超聲微泡組T-NOS活力分別為（8.33±1.05）U/ml、（7.81±0.82）U/ml、（15.60±1.26）U/ml；i-NOS 活力 3 組分別為 （5.50±0.47）U/ml、（5.25±0.50）U/ml、（10.81±0.95）U/ml；T-NOS 活力減去i-NOS可得到c-NOS活力分別為（2.82±0.24）U/ml、（2.56±0.30）U/ml、（4.78±0.36）U/ml。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，超聲組各型NOS活力較對(duì)照組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而超聲微泡組i-NOS和c-NOS活力較對(duì)照組有顯著性增加（P<0.05），又以i-NOS增加更明顯（圖2）。

3 討論

移植干細(xì)胞治療缺血性心肌病的關(guān)鍵是移植細(xì)胞到達(dá)缺血區(qū)并存活，并進(jìn)一步分化為心肌細(xì)胞或發(fā)揮旁分泌治療作用。NO是體內(nèi)活性氣體分子，有廣泛生理病理作用，包括調(diào)節(jié)血管舒張功能，抗血小板聚集，增加血管通透性，促進(jìn)血管新生，調(diào)節(jié)其他促血管生長因子功能。體內(nèi)NO由NOS催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成。不同類型細(xì)胞中，存在不同類型的NOS，通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生NO?，F(xiàn)已知NOS有3種類型，廣義的將其分為2種，即構(gòu)成型一氧化氮合酶（cNOS）和細(xì)胞因子誘導(dǎo)型（iNOS）。cNOS包括主要分布在內(nèi)皮組織的eNOS和神經(jīng)系統(tǒng)的nNOS，合成基礎(chǔ)NO，調(diào)節(jié)生理功能。iNOS在靜息細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子或炎性刺激時(shí)，催化合成非生理濃度的大量NO。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，超聲介導(dǎo)微泡作用下EPCs生成NO明顯增加，EPCs各亞型NOS活性均有所增強(qiáng)，又以i-NOS增加更明顯?？梢酝茰y，體內(nèi)血管局部NO濃度增加，從而引起血管擴(kuò)張，血流速度減慢，有利于EPCs邊集。近期實(shí)驗(yàn)表明［4］，NO能夠降解內(nèi)皮層鈣黏蛋白復(fù)合物，激活金屬蛋白酶-9（MMP-9）降解細(xì)胞外基質(zhì)，使血管通透性增加，促進(jìn)EPCs游出血管，在心肌組織間遷移。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［5，6］，心肌局部 NO 生成增加，能夠增強(qiáng)大鼠心肌梗死區(qū)血管新生，改善心肌纖維化和心功能，提高生存率。

eNOS在EPCs遷移、分化形成微血管中也起重要作用。Sasaki等［7］應(yīng)用eNOS增強(qiáng)子AVE9488體外預(yù)處理EPCs，eNOS mRNA表達(dá)增加，相應(yīng)酶活性增強(qiáng)，結(jié)果使干細(xì)胞遷移能力明顯提高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明上述預(yù)處理移植EPCs能夠明顯增加缺血后肢新生血管密度和血流灌注，改善后肢運(yùn)動(dòng)功能。而且NOS活性對(duì)心肌缺血和再灌注損傷也有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與移植EPCs的eNOS、iNOS活性和分泌VEGF有關(guān)，其中eNOS對(duì)一過性缺血，iNOS對(duì)慢性持續(xù)缺血有抗炎性作用［8］。

綜上所述，超聲（1 MHz，1W/cm2，90 s）介導(dǎo)微泡能夠增強(qiáng)EPCs的NOS活性，增加NO生成，可能影響EPCs的黏附、遷移、存活、增殖和分化的各個(gè)環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮增強(qiáng)干細(xì)胞治療心肌梗死的作用。目前該作用的具體機(jī)制尚不明確，尚需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

［1］童嘉毅，馬根山，馮毅，等．超聲波促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌內(nèi)歸巢的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國心血管病研究雜志，2008，6（10）：771-773．

［2］徐琢，馮毅，童嘉毅，等．超聲微泡輔助干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究［J］．東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，27（3）：192-194．

［3］范國峰，馮毅，童嘉毅，等．超聲聯(lián)合微泡對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響［J］．東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，30（2）：109-112．

［4］Dong Y，Ludovic W，Téni G，et al.Increase in vascular permeability and vasodilation are critical for proangiogenic effects of stem cell therapy［J］．Circulation，2006，114（4）：328-338．

［5］Landmesser U，Engberding N，Bahlmann FH，et al．Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization，myocardial neovascularization，left ventricular function，and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase［J］．Circulation，2004，110（14）：1933-1939．

［6］Bulhak AA，Sjoquist PO，Xu CB，et al．Protection against myocardial ischaemia/reperfusion injury by PPAR-alpha activation is related to productionofnitricoxideand endothelin-1［J］．Basic ResCardiol，2006，101（3）：244-252．

［7］Sasaki K，Heeschen C，Aicher A，et al．Ex vivo pretreatment of bone marrow mononuclear cells with endothelial NO synthase enhancer AVE9488 enhances their functional activity for cell therapy［J］．Proc Nat Acad Sci USA，2006，103（39）：14537-14541.

［8］Masaaki I，Hiromi N，Atsushi I，et al．Endothelial progenitor cells are rapidly recruited to myocardium and mediate protective effect of ischemic preconditioning via“imported”nitric oxide synthase activity［J］．Circulation，2005，111（9）：1114-1120．