12例化生性乳腺癌臨床病理分析

張斌斌， 李 青

乳腺癌是一組包含顯著多樣性的惡性腫瘤。最近的研究表明，根據(jù)基因芯片表達(dá)譜的不同，乳腺癌可分為5種分子表型:基底樣型、管腔A型、管腔B型、HER2(人表皮生長因子受體2)過表達(dá)型和正常乳腺樣型［1-3］。就生物學(xué)行為來看，基底樣型和HER2過表達(dá)型比管腔表型和正常乳腺樣表型更具侵襲性［2，4-5］。Nielsen 等［2］提出了一個(gè)包括 ER(雌激素受體)、PR(孕激素受體)、EGFR(表皮生長因子受體)、HER2和CK5/6(細(xì)胞角蛋白5/6)5種抗體在內(nèi)的免疫組化套餐，用于對乳腺癌的基因表型進(jìn)行診斷和鑒別診斷?；匀橄侔┏０喾N異質(zhì)性成分，如肉瘤樣成分、鱗癌或差分化癌、梭形細(xì)胞癌、良性間葉成分及壞死組織等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6-8］，大約5%的乳腺癌的預(yù)后因素并不清楚。根據(jù)免疫組化表達(dá)譜分析，化生性乳腺癌細(xì)胞具有肌上皮樣分化的特征［9-10］。但關(guān)于化生性乳腺癌的臨床病理特征仍然不是很清楚。因此我們對12例化生性乳腺癌中 ER、PR、HER2、EGFR、CK5/6、CK14(細(xì)胞角蛋白14)和P63的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對其臨床病理特征進(jìn)行回顧性分析。同時(shí)還對化生性乳腺癌組織進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)及電鏡檢查，同時(shí)還進(jìn)行生存分析，以期闡明化生性乳腺癌與基底樣乳腺癌的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本選擇和臨床病理參數(shù)分析 收集昆山市中醫(yī)院和南京市婦幼保健院病理科2004年7月至2009年12月間化生性乳腺癌標(biāo)本共12例。所有標(biāo)本均經(jīng)中性福爾馬林固定后石蠟包埋。HE染色切片由兩位高年資病理醫(yī)生診斷。組織學(xué)分級采用Bloom-Richardson分級標(biāo)準(zhǔn)［11-12］。臨床病理參數(shù)包括初始病理診斷、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)亞型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、手術(shù)類型、激素治療、化療、放療和生存時(shí)間。

1.2 免疫組織化學(xué) 標(biāo)本采用4%的甲醛固定，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察。免疫組化采用En-Vision二步法，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB-H2O2顯色。第一抗體為 ER、PR、HER2、CK5/6、CK14、P63和 EGFR。ER、PR 購自 Thermo公司，HER2、EGFR購自DAKO公司，CK5/6購自Zymed公司，CK14購自邁新公司，P63購自Neomarkers公司。免疫組化結(jié)果判斷:細(xì)胞核、胞質(zhì)或細(xì)胞膜上棕黃色顆粒為陽性著色。按標(biāo)本中陽性細(xì)胞百分比分別計(jì)為－、+、++、+++4個(gè)等級，不著色為 －，0～25%為 +，25% ～50%為++，＞50%為+++。

1.3 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) HER2基因擴(kuò)增檢測采用FISH方法。HER2基因探針位于17號染色體17q11.2-q12，對照探針位于17號染色體17p11.1-q11.1。切片的準(zhǔn)備和雜交實(shí)驗(yàn)按照FISH試劑盒(DAKO公司)說明書進(jìn)行。每一張組織切片計(jì)數(shù)30個(gè)腫瘤細(xì)胞核紅色HER2信號和綠色CEN17(17號染色體著絲粒)信號，并計(jì)算HER2/CEN-17的比值(Ratio)。如果HER2/CEN-17 Ratio＞2.2則認(rèn)為HER2基因擴(kuò)增。如果Ratio＜1.8則認(rèn)為無HER2基因擴(kuò)增。如果Ratio介于1.8和2.2之間，增加計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞核信號并重新計(jì)算HER2/CEN17比值。

1.4 電鏡觀察 新鮮腫瘤組織，2.5%冷戊二醛固定，4℃過夜，0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗 1 h，1%鋨酸固定1 h，丙酮梯度脫水后，Epon812樹脂包埋，制成70 nm超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，應(yīng)用JEM-1011透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法和Cox回歸。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P＜0.01具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特點(diǎn) 12例化生性乳腺癌患者皆為女性。平均年齡為54歲(38～82歲)。4例為絕經(jīng)前、8例為絕經(jīng)后患者。組織學(xué)診斷，6例為上皮亞型(4例鱗癌，2例為腺鱗癌)，4例為上皮和間葉雙向分化亞型(3例癌伴軟骨樣化生，1例癌伴骨樣化生)，2例為單向梭形細(xì)胞癌。形態(tài)學(xué)上，鱗狀細(xì)胞癌呈現(xiàn)小片狀分布，部分呈囊狀，內(nèi)襯鱗狀上皮，細(xì)胞具有異型性，可見細(xì)胞角化。腺鱗癌由成型的腺管形成區(qū)和散在分布的實(shí)性鱗狀上皮巢團(tuán)混合組成。伴梭形細(xì)胞化生者表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞呈梭形，浸潤至間質(zhì)中呈不規(guī)則分布(圖1A、B)。癌伴軟骨化生和骨化生表現(xiàn)為浸潤性乳腺癌成分中分別混有良性和惡性分化的軟骨和骨(圖1C)。

圖1 化生性乳腺癌的形態(tài)學(xué) A:梭形細(xì)胞化生乳腺癌(HE染色，×400)B:梭形細(xì)胞化生乳腺癌間質(zhì)浸潤(HE染色，×400)C:化生性乳腺癌具有惡性軟骨樣化生和良性的骨樣化生(HE染色，×400)

X線鉬靶檢查顯示乳腺腺體呈混合型，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，腫瘤結(jié)節(jié)邊緣模糊，可見毛刺樣改變(圖2A)。腫瘤大小平均為 3.45(1.7 ～4.6)cm，其中只有1例腫瘤直徑小于2 cm，其余皆大于2 cm。12例皆有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3例有1～3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，另9例有4～7枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織學(xué)分級均為Ⅲ級。TNM分期Ⅱ期3例，Ⅲ期9例。12例均實(shí)施了乳腺癌改良根治術(shù)，并接受了化療(taxotere and adriamycin and cyclophosphamide，TAC)、激素治療和放療(見表1)。

表1 12例化生性乳腺癌的臨床病理特點(diǎn)和治療、隨訪情況

2.2 FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果 FISH檢測結(jié)果示腫瘤細(xì)胞HER2基因呈紅色信號，CEN17呈綠色信號。12例HER2/CEN17 Ratio均＜1.8。FISH檢測結(jié)果示化生性乳腺癌中無HER2基因擴(kuò)增(圖2B)。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果示所有化生性乳腺癌癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有相似之處。具有腺鱗癌化生的化生性乳腺癌胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見張力原纖維(圖2C)，細(xì)胞間可見較多的密體(圖2D)。具有梭形細(xì)胞化生的化生性乳腺癌胞漿內(nèi)可見細(xì)肌絲和密體(圖2D)。

2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果示12例化生性乳腺癌ER、PR、HER2免疫組化反應(yīng)陰性，CK5/6(圖3A)和CK14(圖3B)胞漿陽性率為100%(12/12)和75.0%(9/12)，EGFR(圖3C)胞膜陽性率為 83.3%(10/12)，P63(圖 3D)胞核陽性率為66.7%(8/12)，詳細(xì)結(jié)果見表 2。

圖2 化生性乳腺癌X線鉬靶和FISH及透射電鏡觀察結(jié)果 A:X線鉬靶檢測示乳腺左外上象限兩個(gè)結(jié)節(jié)B:FISH實(shí)驗(yàn)示無HER2基因擴(kuò)增(×400)C:透射電鏡示胞漿內(nèi)的張力原纖維絲(紅色箭頭)D:透射電鏡示胞漿內(nèi)細(xì)肌絲(紅色箭頭)和密體(綠色箭頭)

圖3 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A、B:瘤細(xì)胞示CK5/6(A，×400)和CK14(B，×400)胞漿陽性C:瘤細(xì)胞示EGFR胞膜陽性(×400)D:瘤細(xì)胞示P63核陽性(×400)

表2 12例化生性乳腺癌免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 方差分析結(jié)果顯示CK5/6、CK14、P63和EGFR免疫組化陽性細(xì)胞百分比之間的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.080，P=0.000)。多重比較分析發(fā)現(xiàn)CK5/6和CK14之間(P=0.003)及 CK5/6 和 P63 之間(P=0.000)的陽性表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CK5/6和EGFR之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示≤54歲年齡組與＞54歲年齡組的生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.898，P=0.048)(圖4A)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)≤3和＞3兩組之間生存率差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.156，P=0.002)(圖4B)。Cox回歸生存分析結(jié)果顯示12例化生性乳腺癌皆可進(jìn)入分析，其中11例隨訪至今仍存活，1例死亡，存活率為91.7%，年齡變量和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)變量與化生性乳腺癌的生存相關(guān)(χ2=10.835，P=0.004)。

圖4 生存分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A:Kaplan-Meier生存分析示≤54歲和＞54兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)B:Kaplan-Meier生存分析示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≤3和＞3兩組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)

3 討論

免疫組化結(jié)果顯示，12例患者ER、PR和HER2皆為陰性，即所謂的“三陰性”［13-15］，并且FISH檢測也顯示HER2/CEN-17 Ratio均＜1.8，進(jìn)一步證實(shí)了化生性乳腺癌內(nèi)無HER2基因擴(kuò)增。此外，CK5/6(100%)和EGFR(83.3%)免疫染色陽性，據(jù)此我們可以認(rèn)為化生性乳腺癌為基底樣表型。CK14(75.0%陽性)和P63(66.7%陽性)為基底/肌上皮標(biāo)記物，其陽性進(jìn)一步表明化生性乳腺癌的癌細(xì)胞是向基底/肌上皮方向分化，在其分化過程中可形成癌和肉瘤樣轉(zhuǎn)化。Reis-Filho等［16］的研究表明，不論化生的具體成分如何，化生性乳腺癌均表現(xiàn)為基底樣表型。在其研究中，CK5/6、CK14、EGFR和P63免疫反應(yīng)陽性率低于我們的實(shí)驗(yàn)組，可能是其實(shí)驗(yàn)樣本量(63例)多于本實(shí)驗(yàn)組所致。此外，他們只對實(shí)驗(yàn)中3例HER2蛋白表達(dá)陽性的病例進(jìn)行了FISH實(shí)驗(yàn)，可能也是影響其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因之一。而在我們的研究中，12例患者皆進(jìn)行了FISH實(shí)驗(yàn)檢測HER2基因擴(kuò)增情況，因此我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在某種程度上更為可靠合理。

超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見張力原纖維、橋粒、細(xì)肌絲和密體。在Yang等［17］的化生性乳腺癌研究中，電鏡下在癌細(xì)胞胞漿中可見張力原纖維絲，在橫紋肌肉瘤細(xì)胞中可見肌小節(jié)和細(xì)肌絲，其研究結(jié)果與我們相似。這些結(jié)果均為化生性乳腺癌向基底/肌上皮方向分化提供了一定證據(jù)。

方差分析結(jié)果顯示CK5/6、CK14、P63和EGFR免疫組化陽性細(xì)胞百分比與化生性乳腺癌診斷具有顯著相關(guān)性，其中CK5/6在診斷化生性乳腺癌時(shí)比CK14和P63更敏感。生存分析結(jié)果顯示年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與化生性乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)，而腫瘤部位、組織學(xué)亞型、組織學(xué)分級、腫瘤大小和TNM分期與化生性乳腺癌的預(yù)后無明顯相關(guān)性。Cox回歸生存函數(shù)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，化生性乳腺癌的生存率逐漸降低，22個(gè)月時(shí)，生存率幾乎為零(圖5A)。Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，化生性乳腺癌的死亡風(fēng)險(xiǎn)越來越高，25個(gè)月時(shí)，其死亡風(fēng)險(xiǎn)是初始階段的7.5倍(圖5B)。Cox回歸函數(shù)方程顯示，年齡越小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)越少，其生存率越高。

Abd El-Rehim等［18］研究表明，基底樣標(biāo)記物的表達(dá)與化生性乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。Rakha等［19］研究結(jié)果顯示組織學(xué)分級Ⅲ級與預(yù)后有相關(guān)性。Podetta等［20］的研究結(jié)果顯示，化生性乳腺癌的預(yù)后與CK5/6不相關(guān)，而與ER缺失和cyclin E表達(dá)相關(guān)。雖然許多學(xué)者研究了基底樣乳腺癌的預(yù)后相關(guān)因素，但確切預(yù)后相關(guān)因素仍然不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

我們的研究結(jié)果表明化生性乳腺癌實(shí)際上是基底樣乳腺癌亞型。CK5/6、CK14、P63和EGFR可作為化生性乳腺癌的診斷標(biāo)記物，而在化生性乳腺癌的診斷和鑒別診斷中，CK5/6比CK14和P63更為敏感?；匀橄侔┑念A(yù)后與年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。本組研究樣本量較少，有可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所影響。因此，化生性乳腺癌的確切臨床病理特征仍然需要我們不斷深入研究，尤其需要大樣本量的回顧總結(jié)。

圖5 Cox回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A:Cox回歸生存函數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與化生性乳腺癌預(yù)后相關(guān)(P＜0.01)B:Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示化生性乳腺癌患者術(shù)后25個(gè)月時(shí)死亡風(fēng)險(xiǎn)最高，其死亡風(fēng)險(xiǎn)是初始階段的7.5倍

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