賁門癌組織中nm23-H1、MMP-2的表達(dá)與臨床意義

李良軍， 趙元錳， 張燦斌， 張 克， 王光華

賁門癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中位于前列。目前雖然在賁門癌的早期診斷與綜合治療方面取得較大進(jìn)展，但大多數(shù)中晚期患者綜合治療后的5年生存率仍不超過24%［1］。導(dǎo)致患者死亡的主要原因是腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，約有45%的患者死于轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，分析其與賁門癌生物學(xué)行為的相關(guān)性有重要的臨床意義。賁門癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素和多階段演變的過程，該過程與多種原癌基因激活及抑癌基因失活，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因失活相關(guān)［2］。

nm23是第一個(gè)被分離出來的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。nm23-H1基因是nm23基因家族成員之一，與人類惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系較密切，其表達(dá)水平與多種腫瘤轉(zhuǎn)移行為和預(yù)后相關(guān)［3］。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)中的MMP-2被認(rèn)為是參與降解基底膜(BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，影響組織的重塑并促進(jìn)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成的主要成分［4］。本研究采用免疫組化SP法聯(lián)合檢測腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2在賁門癌中的表達(dá)，探討nm23-H1和MMP-2與賁門癌的浸潤、轉(zhuǎn)移、臨床病理分期的關(guān)系，為賁門癌的臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集及制作 收集2005—2009年河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的賁門癌57例資料。全部病例臨床資料完整。賁門癌病例的腫瘤中心均位于齒狀線上1 cm至齒狀線下2 cm范圍內(nèi)，符合Siewert賁門癌的分型標(biāo)準(zhǔn)［5］。男39例，女18例;年齡32～78歲，平均63.8歲;高分化腺癌14例，中分化腺癌21例，低分化腺癌22例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性32例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性25例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放化療。另外收集正常賁門黏膜25例作為對照組。全部標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)所用試劑nm23-H1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，MMP-2單克隆抗體及SP試劑盒、DAB顯色劑等均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化SP法檢測賁門組織中nm23-H1和MMP-2表達(dá)情況。將組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，用檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)抗原，嚴(yán)格按照試劑盒說明的步驟操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固玻片。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 在正常賁門黏膜及賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)。高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取10個(gè)視野，按細(xì)胞染色的百分率及染色的深淺程度采用二級計(jì)分法判定陽性結(jié)果。(1)細(xì)胞染色率＜10%為0分，10% ～25%為1分，25% ～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%記為4分;(2)按染色的深淺程度計(jì)分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。二者計(jì)分相乘數(shù)值＞1者判定為陽性［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法計(jì)算，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常賁門黏膜與賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2的陽性表達(dá) nm23-H1陽性表達(dá)呈顆粒狀定位于細(xì)胞漿中，淺黃色至棕黃色。比較正常賁門黏膜及賁門癌組織中nm23-H1的陽性表達(dá)率，前者明顯高于后者(23/25 vs.14/57)，二者具有顯著差異性(χ2=31.918，P ＜0.01);MMP-2 陽性著色呈顆粒狀定位于細(xì)胞漿，黃色至棕黃色。MMP-2在正常賁門黏膜中的陽性表達(dá)率明顯低于賁門癌組織(5/25 vs.42/57)，有顯著差異性(χ2=20.472，P ＜0.01)。見表1。

表1 正常賁門黏膜與賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2的陽性表達(dá)率

2.2 MMP-2和nm23-H1在賁門癌中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 MMP-2的陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級相關(guān)(P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.01)，與年齡、性別無關(guān)(P ＞ 0.05);nm23-H1蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P ＜0.01，P ＜0.05)，與性別、年齡及組織學(xué)分級無相關(guān)性(P＞0.05)。見表2。

表2 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中的陽性表達(dá)與病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中陽性表達(dá)的相關(guān)性分析 nm23-H1陽性表達(dá)的14例中MMP-2陽性占4例，nm23-H1陰性表達(dá)的43例中MMP-2陽性占38例;MMP-2蛋白陽性表達(dá)的42例中nm23-H1陽性4例，MMP-2陰性表達(dá)的15例中nm23-H1陽性占10例;二者均陰性共5例。nm23-H1與MMP-2陽性表達(dá)率呈顯著負(fù)相關(guān)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r= － 0.585，χ2=19.478，P ＜0.01)，見表3。

表3 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中的表達(dá)關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生與癌基因和抑癌基因的異常關(guān)系密切，但在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移這一特定階段，涉及到轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因和轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)異常。nm23是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，nm23-H1是nm23腫瘤抑制基因家族中的代表，與腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制關(guān)系十分密切。定位于17號染色體長臂(17q22)，主要表達(dá)產(chǎn)物為二磷酸核苷激酶(NDPK)，參與體內(nèi)磷酸核苷的生成，通過影響微管聚合狀態(tài)參與G蛋白的信號傳遞和微管聚合酶的活化而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，其活性與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增生過程有關(guān)［7］。nm23-H1的表達(dá)與乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的高轉(zhuǎn)移潛能顯著負(fù)相關(guān)，被認(rèn)為是顯著的轉(zhuǎn)移抑制基因［8］。但是由于腫瘤轉(zhuǎn)移過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的復(fù)雜性及調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)性，nm23-H1表達(dá)水平雖可對判斷某些腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起重要參考作用，但其在臨床診斷中尚不能作為腫瘤獨(dú)立的綜合預(yù)后因子［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，正常賁門黏膜與賁門癌組織相比，nm23-H1陽性表達(dá)率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示nm23-H1具有一定抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性，其表達(dá)的缺失可能引起腫瘤的轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞侵襲力更強(qiáng)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類依賴鋅離子的內(nèi)肽酶，屬重要的蛋白水解酶類，經(jīng)典型MMP以水溶性酶原形式被分泌至胞外，在激活劑的作用下脫去前肽而具有蛋白水解酶活性，通常由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及結(jié)締組織細(xì)胞分泌，能降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜(BM)類纖維膠原，在腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。MMP-2是MMPs家族重要成員之一，分子量72 KD，激活后的MMP-2能降解ECM及BM中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和纖維連接蛋白成分，導(dǎo)致基底膜破壞，腫瘤細(xì)胞浸潤結(jié)締組織基質(zhì)，侵入小血管和淋巴管而發(fā)生轉(zhuǎn)移［10］。關(guān)于MMP-2與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系國內(nèi)外已有大量的實(shí)驗(yàn)研究，原位雜交技術(shù)揭示了結(jié)腸癌間質(zhì)細(xì)胞能合成MMP-2，并與癌細(xì)胞共同參與浸潤癌特異性組織重塑和基底膜降解過程［11］。本研究結(jié)果顯示MMP-2在正常賁門黏膜組織中陽性表達(dá)率較低，而在賁門癌組織中陽性表達(dá)率較高，兩者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且與賁門癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級密切相關(guān)(P＜0.05)，提示其表達(dá)增高能促進(jìn)賁門癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在賁門癌組織中nm23-H1與MMP-2的表達(dá)兩者之間存在顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.585，P ＜0.01)，nm23-H1 的低表達(dá)提示其抑癌基因功能的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常，并進(jìn)一步促使MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增高，導(dǎo)致BM與ECM降解，加速賁門癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。隨著腫瘤浸潤程度的加深與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的進(jìn)展，nm23-H1陽性表達(dá)率減低，MMP-2的陽性表達(dá)率增高，這與腫瘤的臨床病理分期密切相關(guān)，提示二者的表達(dá)可能為復(fù)雜腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成部分，前者屬上游調(diào)控基因［12］，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。聯(lián)合對nm23-H1與MMP-2蛋白表達(dá)的檢測可能成為臨床判斷賁門癌分化及浸潤轉(zhuǎn)移潛能的重要參考指標(biāo)，并提示其早期診斷的可能。

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