錯配修復基因hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)性與胃癌危險性的研究

陸 波， 肖獻秋， 洪 巖， 高 興， 張國強， 周鳳英， 董 曉， 龔偉達

胃癌是全世界第4大常見腫瘤和第2位常見腫瘤死因，2002年新發(fā)胃癌病例達934 000，每年死亡人數(shù)達700 000［1］。大約2/3病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中中國占42%［1］。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首，每年死于胃癌的患者多達 16 萬人［2］。

胃癌的發(fā)生發(fā)展與其他許多惡性腫瘤一樣，也是多基因、多因素參與的多步驟、多階段的復雜過程。近年來研究表明，DNA損傷的堿基錯配修復(mismatch repair，MMR)通路基因的突變也參與了腫瘤的發(fā)病機制，并且可能是腫瘤發(fā)生的早期分子事件。MMR通路中最常發(fā)生突變的基因是hMSH2和hMLH1。hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)性位點位于第13外顯子內含子剪接受體位點的上游第6位核苷酸。內含子位點的多態(tài)性可能影響RNA剪接，從而改變該基因蛋白的表達，導致攜帶不同該基因型的個體對疾病易感性的差異。研究報道［3-4］，hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)與許多腫瘤的發(fā)生有關，如肺癌、霍奇金淋巴瘤等，但尚未見該位點與胃癌遺傳易感性的關聯(lián)性研究報道。我們推測，hMSH2基因多態(tài)變異可能與胃癌遺傳易感性存在關聯(lián)。基于此，本研究采用TaqMan MGB探針對hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)進行基因分型，以探討其與胃癌發(fā)生風險的關系，該研究將對進一步揭示胃癌的遺傳學機制具有重要的意義，也為今后實施胃癌的個體預防和治療提供一定依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

隨機收集自2006年3月至2010年2月宜興市人民醫(yī)院住院并經(jīng)病理確診的胃癌患者以及住院的非胃癌患者。病例組552例，其中男性377例，女性175例，平均年齡63.0歲( ±9.9歲);對照組592例(年齡、性別均相匹配)，其中男性391例，女性201例，平均年齡63.4歲(±10.4歲)。中位年齡均為63.0歲。所有患者術前均未行化療或放療。病例組和對照組均完成問卷調查并愿意提供10 mL新鮮外周血，所有血樣在6 h內保存于－20℃冰箱。吸煙者指每天至少1支，連續(xù)半年以上;飲酒者指每周至少1次，持續(xù)1年以上。胃癌臨床病理學特征:組織學分型采用Lauren分型［5］。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用酚-氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA的量，瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的完整性。

1.2.2 基因分型 采用Taqman MGB探針方法對hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)進行基因分型。分型原理:不同的等位基因對應不同的熒光，等位基因T對應FAM熒光，C對應HEX熒光，根據(jù)兩種熒光的不同Ct值區(qū)分出不同的基因型(如圖1所示)。對于分散的點，根據(jù)擴增曲線來判斷基因型。同時抽取10%的樣本采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進行驗證，結果相一致。引物及探針均由南京驥驁生物技術有限公司設計及合成。上游引物為5'-GAA TAT ATG TTG ATT TAC CTC CCA TAT TG-3'，下游引物為5'-CAA TCC ATT TAT TAG TAG CAG AAA GAA GTT-3';TaqMan探針1 為5'-FAM-CCT ACA AAA CAA ATT AP-3'，探針2為5'-HEX-CCT ACA GAA CAA ATT AP-3'(其中P代表TaqMan-MGB基團)。10 μL PCR反應體系包括 ddH2O 2.8 μL，Realtime Probe qPCR Mix 5 μL，正反義引物各0.3 μL，TaqMan 探針1 及2 各0.2 μL，50 × Rox reference dye 0.2 μL，模板 DNA 1 μL。PCR反應程序包括預變性95℃ 10 min，變性95℃15 s，退火及延伸60℃ 1 min，共45個循環(huán)，儀器自動收集熒光信號，SDSV1.3.2軟件分析給出基因分型結果。

圖1 等位基因分型圖

1.3 統(tǒng)計學方法

以擬合優(yōu)度 χ2檢驗分析hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)各基因型在對照組中分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，以確認研究樣本的群體代表性。χ2檢驗比較研究人群年齡、性別、吸煙、飲酒等因素頻數(shù)分布差異。單因素及多因素Logistic回歸計算比值比(odds ratios，ORs)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals，CIs)，分析各基因型與胃癌發(fā)生風險的關聯(lián)性，并對年齡、性別、吸煙及飲酒進行分層分析。采用SAS9.1統(tǒng)計軟件(SAS Institute，Cary，NC)，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究群體的基本特征

病例組和對照組的基本信息如表1所示:病例組和對照組在性別與年齡頻數(shù)分布上無統(tǒng)計學意義(P值分別為 0.456和 0.200)。病例組吸煙者(45.0%)和飲酒者(33.3%)高于對照組吸煙者(29.4%)和飲酒者(25.0%)，差異有統(tǒng)計學意義，P值分別為＜0.001和0.003。病例組腫瘤位于賁門211 例(41.9%)，非賁門293 例(58.1%);組織學分型:彌漫型239 例(46.3%)，腸型277 例(53.7%)。

表1 胃癌組和對照組的基本信息

2.2 hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)性和胃癌發(fā)生風險的關聯(lián)性

hMSH2基因IVS12-6T＞C各基因型在對照組中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.34，P=0.558)。分布頻率為:TT，240 例(40.6%);TC，279 例(47.1%);CC，73(12.3%)例。在胃癌組中的分布頻率為:TT，230例(41.7%);TC，258例(46.7%);CC，64 例(11.6%)。以野生基因型 TT為參照，攜帶突變T等位基因的基因型TC和CC在病例和對照組中頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.882和0.569);合并突變基因型(TC+CC)與野生型TT相比與胃癌發(fā)生風險無明顯關聯(lián)(調整 OR=0.96，95%CI=0.75 ～ 1.23，P=0.756)。結果見表 2。

表2 hMSH2IVS12-6T＞C基因型和胃癌發(fā)生風險的關聯(lián)性

2.3 hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)性和胃癌發(fā)生風險的分層分析

我們對年齡、性別、吸煙、飲酒等因素進行分層分析，發(fā)現(xiàn)hMSH2IVS12-6T＞C合并突變基因型與年輕人群(年齡≤63歲)胃癌和年老人群胃癌(年齡 ＞63歲)的發(fā)生風險無顯著關聯(lián)性(調整OR=0.99，95%CI=0.70 ～ 1.30 和調整 OR=0.93，95%CI=0.64 ～1.33)，同時也發(fā)現(xiàn)與性別、吸煙、飲酒等因素亦無顯著關聯(lián)性。結果見表3。

3 討論

DNA錯配修復(mismatch repair，MMR)通路廣泛存在于生物體中，是進化保守的生化通路，首先在細菌中發(fā)現(xiàn)，主要功能是修復DNA復制過程中產(chǎn)生的錯配，維護基因組完整性和穩(wěn)定性［6］。人類MMR通路由 7 個基因組成:MSH2、MSH6、MSH3、MLH1、PMS2、PMS1 和 MLH3［7-8］。其中 hMSH2 基因是第一個被分離到的人類錯配修復基因，于1993年Fishel等克隆。該基因與細菌MutS同源，位于人類染色體2p21-22，其基因組全長約73Kb(不包括啟動子)，含16個外顯子，其中第7個外顯子最長，有279bp，而第11個外顯子最短為98bp，cDNA全長3 111bp，含2 727bp的開放閱讀框架，編碼蛋白含934個氨基酸殘基［9］。hMSH2通過與hMSH6或hMSH3蛋白結合形成異源二聚體，可以識別并結合到錯配的DNA序列，從而在錯配修復中發(fā)揮作用。

hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)與許多腫瘤的發(fā)生風險有關，Palicio等［10］對西班牙人群進行病例-對照研究，發(fā)現(xiàn)IVS12-6CC等位基因可使結直腸癌的發(fā)生危險性增高(調整 OR=2.48，95%CI=1.08～5.66)。但也有相反報道，Raptis等［11］報道該位點的多態(tài)性與加拿大人群結直腸癌的發(fā)生風險無關聯(lián)性。在韓國人群，Jung等［3］的研究表明攜帶IVS12-6CC基因型的個體與IVS12-6TT基因型個體相比，發(fā)生肺癌的危險性增高(調整OR=1.52，95%CI=1.02 ～2.27，P=0.01)。Hishida 等［4］對 103 例日本非霍奇金淋巴瘤患者和487例對照者的研究中發(fā)現(xiàn)，IVS12-6CC基因型可增加非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生風險(調整 OR=1.44，95%CI=0.94 ～2.23)，但不具有顯著性差異。

表3 hMSH2IVS12-6T＞C基因型和胃癌發(fā)生風險的分層分析

我們采用TaqMan MGB探針，針對IVS12-6T＞C位點進行基因分型。反應體系包括一對引物及2個分別檢測不同等位基因的MGB探針，根據(jù)不同的等位基因對應不同的熒光，探針的5'端標記FAM(檢測T等位基因)或HEX(檢測C等位基因)，3'端標記不發(fā)光的淬滅基團并連接一個MGB基團。連接MGB基團的探針可與互補的DNA形成高度穩(wěn)定的雙螺旋，大大增加配對與非配對模板間的Tm值差異，Johnson等［12］報道該方法錯誤率＜1%。

本研究系病例-對照研究，對一些可能的混雜因素進行了調整，因此研究結果比較可信。但我們的研究結果未發(fā)現(xiàn)hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)性位點與胃癌的發(fā)生風險有顯著關聯(lián)性，分層分析也未發(fā)現(xiàn)他們與研究人群的年齡、性別、吸煙、飲酒等因素有顯著關聯(lián)性，從表2中可以看出，CC基因型可降低胃癌的發(fā)生風險(OR＜1)，但不具有顯著性差異(P＞0.05)，原因可能與種族差異或樣本含量較少有關。

總之，本研究通過TaqMan MGB探針基因分型技術，對hMSH2 IVS12-6T＞C多態(tài)位點進行基因分型，未發(fā)現(xiàn)hMSH2 IVS12-6T＞C多態(tài)變異與中國江蘇宜興人群胃癌發(fā)生風險存在顯著關聯(lián)。本研究結果需在今后的大樣本研究或其他功能學研究中進一步加以驗證。

［1］ Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］ 周標，陳坤.胃癌主要危險因素研究進展［J］.金華職業(yè)技術學院學報，2005，5(3):37-39.

［3］ Jung CY，Choi JE，Park JM，et al.Polymorphisms in the hMSH2 gene and the risk of primary lung cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2006，15(4):762-768.

［4］ Hishida A，Matsuo K，Hamajima N，et al.Polymorphism in the hMSH2 gene gIVS126T＞C and risk of non-Hodgkin lymphoma in a Japanese population［J］.Cancer Genet Cytogenet，2003，147(1):71-74.

［5］ Hohenberger P，Gretschel S.Gastric cancer［J］.Lancet，2003，362(9380):305-315.

［6］ Koessler T，Oestergaard MZ，Song H，et al.Common variants in mismatch repair genes and risk of colorectal cancer［J］.Gut，2008，57(8):1097-1101.

［7］ Jascur T，Boland CR.Structure and function of the components of the human DNA mismatch repair system［J］.Int J Cancer，2006，119(9):2030-2035.

［8］ Jiricny J.The multifaceted mismatch-repair system［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7(5):335-346.

［9］ Fishel R，Lescoe MK，Rao MR，et al.The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer［J］.Cell，1993，75(5):1027-1038.

［10］ Palicio M，Blanco I，Tortola S，et al.Intron splice acceptor site polymorphism in the hMSH2 gene in sporadic and familial colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2000，82(3):535-537.

［11］ Raptis S，Mrkonjic M，Green RC，et al.MLH1-93G ＞A promoter polymorphism and the risk of microsatellite-unstable colorectal cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2007，99(6):463-474.

［12］ Johnson VJ，Yucesoy B，Luster MI.Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology［J］.Cytokine，2004，27(6):135-141.