胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

王殿棟， 段建中， 張克實(shí)， 韓熙淵

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，位居消化道腫瘤第一位。根治性手術(shù)后的5年生存率仍然很低，其主要原因是術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中腹膜種植轉(zhuǎn)移約占50%?，F(xiàn)在認(rèn)為胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移與基因有密切關(guān)系［1］。目前，關(guān)于胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的基因研究主要集中于一些粘附分子、降解酶、細(xì)胞因子和某些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。然而眾多的研究集中于某單個(gè)基因在某一個(gè)過程中的作用。比如，目前研究的轉(zhuǎn)移基因中CD44是最重要的粘附分子［2］，其參與瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和宿主基質(zhì)的粘附，這種異質(zhì)型粘附，在癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起促進(jìn)作用;MMP是目前研究的最重要的降解酶，通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中不同成份的降解，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。但在其他轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)中，以上基因似乎無任何作用［3］。所以促進(jìn)胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的基因可能不是某些單個(gè)基因的結(jié)果，而是諸多基因的協(xié)同作用，進(jìn)而有必要去探索所有與胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移有關(guān)的可疑基因。而要去同時(shí)檢查出所有的可疑基因，就需要一個(gè)高通量的技術(shù)手段來進(jìn)行研究?；蛐酒褪悄壳拜^好的方法［4］?；虮磉_(dá)譜芯片的應(yīng)用，提供了相關(guān)基因的基因組學(xué)的證據(jù)，打破了以往單個(gè)基因孤立研究的局限，是從整體上全面了解整個(gè)基因組多個(gè)基因的變化，為在全基因組范圍內(nèi)尋找與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因變化提供了一個(gè)有效手段。基因芯片技術(shù)可以通過一次性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到數(shù)百至數(shù)千個(gè)基因，并能進(jìn)行平行分析，具有快速、準(zhǔn)確、敏感的特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中［5］。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由包頭醫(yī)學(xué)院侯培珍教授恵贈(zèng);5周齡的BALB/c雄性裸鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005］，共30只，體重20～22 g;芯片雜交的所有試劑、設(shè)備以及技術(shù)均由中科院上海芯超公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901用含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，反復(fù)傳代到細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期。用0.25% 胰蛋白酶消化，用滅菌PBS將細(xì)胞密度調(diào)到1×107個(gè)/mL用于建立動(dòng)物模型。

1.3 動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本收集 將備用的單細(xì)胞懸液0.2 mL注入裸鼠腋窩皮下;SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)裸鼠，每天觀察腫瘤生長情況。待腫瘤長到直徑約1 cm后處死裸鼠，無菌下完整取出腫瘤，選魚肉樣周圍腫瘤組織將其切成直徑約2 mm大小的瘤塊;將瘤塊再置于另一只裸鼠腋窩皮下;如此方法反復(fù)傳代腫瘤3次，最后切成直徑約2 mm大小的瘤塊置于生理鹽水中備用。取剩余裸鼠15只，用20 mg/mL濃度的水合氯醛注射液0.2～0.3 mL行腹膜腔麻醉;所有操作遵循無菌原則，手術(shù)野常規(guī)酒精消毒，取左側(cè)肋弓下斜切口，逐層入腹腔，將胃輕輕拉出，用手術(shù)刀尖輕輕劃開胃漿膜層，長度約2 mm;再用8-0絲線將上述備好的小瘤塊穿透胃全層縫掛于漿膜破損的胃壁區(qū);將胃還納入原位，縫合腹膜及皮膚;術(shù)畢。術(shù)后繼續(xù)SPF級(jí)下飼養(yǎng)裸鼠，并每天觀察腹部生長情況;待裸鼠有腹水形成后脫頸處死，取出原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶;病理檢查證明是腫瘤轉(zhuǎn)移灶;將其置于無菌EP管中迅速液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 探針制備 取出備好的標(biāo)本，每50～100 mg組織中加入1 mL的TRIzol，然后在勻漿器中將組織打碎;均質(zhì)化的樣本在15℃ ～30℃放置5 min，之后加入0.2倍體積的氯仿，蓋緊后將其劇烈搖勻，然后再在15℃ ～30℃放 2～3 min，4℃、7 000 rpm 離心15 min;取上清液并將其置于新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇揺勻，再4℃、7 000 rpm離心15 min，棄上清液;加入70%的酒精，洗去沉淀所含的鹽分，再次4℃、7 000 rpm離 心10 min，棄上清液;以上步驟重復(fù)1次;15℃ ～30℃晾干，加入適量無RNA酶的水溶解;用分光光度儀測(cè)定RNA的濃度，A260/A280接近于2.0為純RNA。經(jīng)檢測(cè)RNA質(zhì)量完好。然后進(jìn)行cRNA合成。取上述cRNA 4 μg 并濃縮至 6.6 μL，加 10 μL 的 DMSO 揺勻，加3.4 μL 的0.3 M NaHCO3并揺勻;將20 μL 的 cRNA混合物加入到熒光染料中并揺勻;水浴、25℃、1 h，再加9 μL的4M Hydroxylamine揺勻后 25℃保溫15 min。進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.5 芯片雜交 取Cy3探針90 pmol，取Cy5探針60 pmol，濃縮至 7 μL，然后轉(zhuǎn)到 0.2 mL PCR 管內(nèi);將溶解的探針置于PCR儀中94℃變性3 min，取出加入 CotIDNA 1 μg，A80lug放回PCR 儀中，70℃保溫30 min;反應(yīng)結(jié)束后，加入9 μL雜交緩沖液和18 μL甲酞胺，總體積達(dá)到36 μL，充分混勻;取雜交液滴加于芯片上，蓋上蓋玻片;將雜交芯片水平放入加有1×PBS的雜交盒，置42℃雜交箱中避光雜交16～18 h。雜交結(jié)束后，用鑷子取出芯片，浸入經(jīng)過50℃預(yù)熱的洗液Ⅰ(1×SSC+0.2%SDS)中，使蓋玻片從芯片上自然脫下，然后在50℃洗液Ⅰ中洗滌10 min;從洗液Ⅰ中取出芯片，浸入50℃預(yù)熱的洗液Ⅱ(0.1 × SSC+0.2%SDS)中，洗滌 10 min，然后再轉(zhuǎn)入新的洗液Ⅱ中，重復(fù)2次;從洗液Ⅱ中取出芯片，室溫洗液Ⅲ(0.1×SSC洗滌5 min，重復(fù)2次);取出芯片于去離子水中室溫洗滌2 min;用鑷子小心將芯片取出，迅速轉(zhuǎn)入50 mL空離心管中，1 500 rpm，5 min，干片;最后將芯片取出立即掃描或放入芯片盒，避光保存于干燥器中。

1.6 獲取數(shù)據(jù) 芯片結(jié)果采用Alight Scanner來獲取圖像，再通過 Imagene轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)，最后應(yīng)用Genespring分析軟件來取差異倍數(shù)Ratio。將轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的比值Ratio≥2或Ratio≤0.5的基因篩選出來作為差異基因。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立 共建立了15只原位移植瘤模型，成功率為100%(15/15)。在胃癌組織塊原位種植后3周左右，上腹部深壓時(shí)可捫及一硬塊，4～5周后裸鼠中上腹部可明顯捫及腫塊，直徑約1 cm大小。之后，瘤體繼續(xù)增大，腹部可見巨大瘤體突起，動(dòng)物極度消瘦、倦怠，對(duì)周圍刺激反應(yīng)差，逐漸出現(xiàn)全身衰竭，有3只死亡。

在移植后8～10周，有6只出現(xiàn)明顯腹部膨隆現(xiàn)象，表明已有腹水形成。裸鼠弓背、喜睡、納差、食欲下降。約第11周，脫頸處死裸鼠，剖腹探查發(fā)現(xiàn)6只均有明顯的腹膜轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶多分布于小腸與結(jié)腸的漿膜上，數(shù)量為每只裸鼠2～3枚，大小不一，最大直徑可有3 mm，隨機(jī)取出1枚轉(zhuǎn)移灶做病理檢查，顯示為低分化腺癌。腹膜轉(zhuǎn)移成功率為40%(6/15)。

2.2 芯片結(jié)果 一般認(rèn)為Ratio(Cy3/Cy5)在0.5～2.0之間為無差別基因，Ratio≥2為上調(diào)基因，Ratio≤0.5為下調(diào)基因，我們發(fā)現(xiàn)了192個(gè)上調(diào)基因和139個(gè)下調(diào)基因?；蛐酒治錾Ⅻc(diǎn)圖見圖1。我們認(rèn)為，Ratio在5～10的上調(diào)基因在腹膜轉(zhuǎn)移過程中可能較有研究價(jià)值，而Ratio在0.3～0.4的下調(diào)基因也可能較有研究價(jià)值，具體見表1、2。

圖1 基因芯片分析散點(diǎn)圖

表1 Ratio位于5～10之間的基因

表2 Ratio位于0.3～0.4之間的基因

3 討論

3.1 關(guān)于裸鼠人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型建立的討論理想的人體腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤生長和轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的重要工具。這些模型必須能夠很好地模擬人體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)行為。一個(gè)很好的胃癌動(dòng)物模型應(yīng)該具備腫瘤在其局部呈浸潤性生長、局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的條件［6］。要建立能很好地模擬人體腫瘤惡性生物學(xué)行為的移植模型，必須使用有高轉(zhuǎn)移潛能的瘤細(xì)胞，使其在相應(yīng)的器官環(huán)境中生長。在人體惡性腫瘤的生物學(xué)特征中，浸潤和轉(zhuǎn)移為其最主要的兩個(gè)特征，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。建立人體腫瘤原位移植動(dòng)物模型的主要目的也是為此特征的研究，進(jìn)而為臨床治療研究提供一個(gè)理想工具。原位移植就是將人體腫瘤接種到與腫瘤原發(fā)部位相對(duì)應(yīng)的移植宿主器官組織內(nèi)，使其獲得與人體腫瘤相似的微環(huán)境。在此環(huán)境中不但有利于腫瘤生長，而且有利于腫瘤惡性行為的表達(dá)。因此，利用原位移植的方法建立人體腫瘤移植動(dòng)物模型也是目前被廣泛接受的腫瘤異種移植方法。目前常用的原位移植方法多是以細(xì)胞懸液的形式建立，但體外培養(yǎng)和懸液制備過程中可能會(huì)破壞腫瘤原有的組織結(jié)構(gòu)，影響腫瘤生物學(xué)特性的進(jìn)一步表達(dá)。新近研究發(fā)現(xiàn)，臨床新鮮標(biāo)本或移植性腫瘤組織保存了腫瘤的原有組織結(jié)構(gòu)，其惡性行為的表達(dá)也更接近于臨床，但臨床新鮮標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞系不確定性也會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來諸多不便。而本課題采用原位移植方法，主要是考慮到課題最終要完成研究致胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的基因，期間不同的腫瘤細(xì)胞系可能會(huì)有不同的致轉(zhuǎn)移情況，所以采用已知的、單一的腫瘤細(xì)胞系可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來更高的準(zhǔn)確性。

既往采用的方法是裸鼠皮下植入人腫瘤細(xì)胞，生長出來的腫瘤組織在形態(tài)、功能、生化特征等方面與人胃癌十分相似，但因其周圍有結(jié)締組織包裹，限制了腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移，即便是選用高轉(zhuǎn)移性的腫瘤也僅能形成局部腫瘤。近年研究發(fā)現(xiàn)，移植瘤是否能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，不僅取決于瘤細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)移潛能，還決定于宿主器官對(duì)應(yīng)的環(huán)境因素，裸鼠體內(nèi)特定的解剖部位所提供的微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要的影響，而且腫瘤細(xì)胞和宿主微環(huán)境的相互影響對(duì)轉(zhuǎn)移過程的完成起著舉足輕重的作用。1889年P(guān)aget提出“種子與土壤”學(xué)說，認(rèn)為只有種子(癌細(xì)胞)與土壤(患者器官微環(huán)境)相互作用才可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤。越來越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到腫瘤生長和親器官性轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的微環(huán)境對(duì)于轉(zhuǎn)移鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)均有不同程度的影響［7］，因而提出建立人類腫瘤模型的原位移植瘤模型。本實(shí)驗(yàn)利用侵襲性很高的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901建立裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移模型，取得了很好的結(jié)果。胃癌成瘤率達(dá)100%，腹膜轉(zhuǎn)移率達(dá)40%。另外，裸鼠的免疫功能差，無排異反應(yīng)是我們能夠成功利用裸鼠建立異體移植瘤的關(guān)鍵。

3.2 關(guān)于芯片結(jié)果的分析和討論 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。惡變的細(xì)胞會(huì)逐漸產(chǎn)生變異并具有腹膜轉(zhuǎn)移的特征。這是由多種癌基因和抑癌基因協(xié)同作用的結(jié)果。通過對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織cDNA芯片的研究表明，在篩選出的差異基因中，無論192個(gè)上調(diào)基因(Ratio≥2)還是139個(gè)下調(diào)基因(Ratio≤0.5)，基本上包括所有功能的基因，如上調(diào)基因中的 S100A4、EGR1、REGⅣ、OSR1、MYH2 等，下調(diào)基因RGS16、CES2、G1P2等。他們大多數(shù)屬于抗氧化活性相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞粘合相關(guān)基因、細(xì)胞代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、酶調(diào)控活性相關(guān)基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相關(guān)的基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性相關(guān)基因、翻譯調(diào)控活性相關(guān)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)基因等［8］。我們將Ratio≤0.5的基因定為下調(diào)基因，即這些基因的表達(dá)下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移。

總之，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是一個(gè)多種基因共同作用的結(jié)果，各基因之間可能會(huì)有相互的促進(jìn)或抑制關(guān)系。這些關(guān)系有待于繼續(xù)研究。

［1］Fidler IL.Critical factors in the biology of human cancer metastasis:twenty-eighth G.H.A.Clowes memorial award lecture［J］.Cancer Res，1990，50(19):6130-6138.

［2］Handorean AM，Yang K，Robbins EW，et al.Silibinin suppresses CD44 expression in prostate cancer cells［J］.Am J Transl Res，2009，1(1):80-86.

［3］Frontczak-Baniewicz M，Walski M，Madejska G，et al.MMP2 and MMP9 in immature endothelial cells following surgical injury of rat cerebral cortex—a preliminary study［J］.Folia Neuropathol，2009，47(4):338-346.

［4］Donato R.SlOO:a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33(7):637-668.

［5］Yamaguchi K，Ura H，Yasoshima T，et al.Liver metastatic model for human gastric cancer established by orthotopic tumor cell implantation［J］.World J Surg，2001，25(2):131-137.

［6］Kaufmann Y，Todorova VK，Luo S，et al.Glutamine affects glutathione recycling enzymes in a DMBA-induced breast cancer model［J］.Nutr Cancer，2008，60(4):518-525.

［7］Marchenko MM，Shmarakov IA，Pasaǐliuk MV.Effect of vitamin A provision on antineoplastic resistance in rats［J］.Vopr Pitan，2008，77(6):4-8.

［8］Dukhanina EA，Lukyanova TI，Romanova EA，et al.Comparative analysis of secretion of S100A4 metastatic marker by immune and tumor cells［J］.Bull Exp Biol Med，2008，145(1):78-80.