Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡與實(shí)驗(yàn)性肺間質(zhì)纖維化

谷 秀,劉宏博,張曉曄,李勝岐,佐久間勉

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院,沈陽(yáng) 110004；2日本金澤醫(yī)科大學(xué))

目前,特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制不清,也無有效的治療方法。許多研究證實(shí)該病過程中存在細(xì)胞因子平衡失調(diào),而且細(xì)胞因子在該病的發(fā)病過程中起重要作用。2007年 2月 ～2008年 4月,我們通過探討特發(fā)性肺纖維化過程中細(xì)胞因子與核因子-κB(NF-κB)的關(guān)系,為闡明肺纖維化的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用 C57BL/6CrSlc小鼠 75只,8周齡,雌性,體質(zhì)量 17～20 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)藥品:鹽酸博萊霉素 A5(平陽(yáng)霉素)(天津市太和制藥有限公司),甲基強(qiáng)地松龍(美國(guó)普強(qiáng)藥廠比利時(shí)分廠),P65的反義寡核苷酸(上海生物工程公司),SABC試劑盒(武漢博士德公司),雙抗夾心 ELISA試劑盒(深圳晶美公司),羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)。

1.2 小鼠肺纖維化模型制備和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)組小鼠氣管內(nèi)滴入博萊霉素 A 55 mg/kg(B組)建立肺纖維化模型,對(duì)照組(A組)小鼠氣管內(nèi)滴入等量的生理鹽水。在氣管內(nèi)滴入博萊霉素前 6 h和滴入后 5 d分別經(jīng)尾靜脈注射 P65反義寡核苷酸 900μg/只(C組),在氣管內(nèi)注入博萊霉素后 1 d和5 d分別經(jīng)尾靜脈給予P65反義寡核苷酸 900μg/只(D組),P65反義寡核苷酸溶于生理鹽水 200μl中,P65反義寡核苷酸的序列為 5′-GAAACAGATCGTCCATGGT-3′[1]。對(duì)照組和模型組在上述相同的時(shí)間經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水。E組為甲基強(qiáng)地松龍組,分別于氣管內(nèi)注入博萊霉素前和注入后的第 1、2天經(jīng)尾靜脈注射甲基強(qiáng)地松龍 150 mg/kg(溶于 200μl生理鹽水中)。A、B、C、D、E組每組各 24只小鼠,分別于 3、7、14、28 d各處死 6只。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) 腹腔注射 1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉小鼠后,眼眶靜脈放血處死動(dòng)物,開胸,結(jié)扎右主支氣管后取出右肺,稱量肺濕重,-70℃保存,待測(cè)羥脯氨酸含量(制成 10%勻漿,3 000 g/min離心 10 min,取上清測(cè)定)。向左肺灌注 10%甲醛,直至肺表面平滑,結(jié)扎左支氣管,取出左肺,放入 10%甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,染色,病理檢查。根據(jù) Szapiel等[2]提供的方法確定肺泡炎及肺纖維化的程度。免疫組化方法檢測(cè)肺組織 NF-κB的表達(dá),用 SABC法試劑盒進(jìn)行檢測(cè),操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 肺泡灌洗液 IFN-γ及 IL-4的檢測(cè) 氣管插管,用預(yù)熱至 37℃的 PBS液灌洗支氣管肺泡,并收集肺泡灌洗液。每次注入 2.5～5.0 ml,反復(fù)沖洗 2次后吸出,共 3次,回收率達(dá) 90%以上?；厥盏墓嘞匆河?℃、1 500 r/min離心 10 min,留取上清液,-70℃凍存。ELISA法測(cè)定 IFN-γ及IL-4的蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以±s表示,以 P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理形態(tài)學(xué) B組 3 d后即可見少量炎癥細(xì)胞滲出,7 d時(shí)達(dá)到高峰,可見彌漫性肺泡炎改變；14 d可見肺泡間隔明顯增厚,28 d肺纖維化達(dá)到高峰,肺泡結(jié)構(gòu)消失,形成廣泛明顯的肺纖維化。E組的病理改變與B組基本相同。C、D組14 d時(shí)未見明顯的肺組織異常,無明顯的肺纖維化形成,28 d時(shí)有極少量的纖維化形成。

2.2 NF-κB免疫組化結(jié)果 見表1。

表1 各組 NF-κB免疫組化核染色陽(yáng)性百分比(%,±s)

表1 各組 NF-κB免疫組化核染色陽(yáng)性百分比(%,±s)

注:與 A組比較,*P＜0.01,△P＜0.05

組別n 3 d 7 d 14 d 28 d A組 6 7.3±1.1 7.8±2.0 7.4±1.4 7.6±0.8 B組 6 34.7±11.2*45.6±3.9* 19.7±1.8△ 14.7±2.3△C組 6 14.6±4.4 15.6±5.0 11.2±3.4 7.9±1.2 D組 6 22.5±1.3*25.6±3.3*15.8±2.7△ 12.6±0.9 E組 6 29.4±4.2*36.7±1.2*21.4±3.7△ 11.6±1.9

2.3 肺泡灌洗液中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 各組肺泡灌洗液中 IL-4、IFN-γ水平比較(pg/ml,±s)

表2 各組肺泡灌洗液中 IL-4、IFN-γ水平比較(pg/ml,±s)

注:與 A組比較,*P＜0.05,△P＜0.01；與 B組比較,#P＜0.05

組別 n IL-4IFN-γIIFN-γ/IL-4 7 d 28 d 7 d 28 d 7 d 28 d A組 6 17.9±1.4 20.5±9.1 189.6±6.3 190.5±2.3 10.6 9.3 B組 6 51.7±1.5△ 68.9±1.1△ 143.2±12.4 132.7±1.9 2.8* 1.9*C組 6 33.2±0.8△# 35.5±2.7△# 165.1±9.1 177.5±9.0 5.0*# 5.0*#D組 6 43.7±2.2△# 39.6±3.5△# 158.0±1.3 161.6±3.2 3.6*# 4.1*#E組 6 49.6±2.1△ 41.0±6.8△ 151.7±4.2 139.2±8.3 3.1* 3.4*

2.4 肺組織羥脯氨酸測(cè)定結(jié)果 見表3。

表3 肺組織羥脯氨酸的測(cè)定(mg/g,±s)

表3 肺組織羥脯氨酸的測(cè)定(mg/g,±s)

注:與 A組比較,*P＜0.05；與 B組比較,△P＜0.05

A組 6 1.3 4±0.1 2 1.4 0±0.3 1 1.4 1±0.4 4 1.4 3±0.3 2 B組 6 1.3 9±0.2 6 2.0 7±0.3 5* 2.3 3±0.1 4* 3.0 7±0.1 7*C組 6 1.4 1±0.3 5 1.6 6±0.3 3*△ 1.8 5±0.1 9*△ 1.9 1±0.2 8*△D組 6 1.3 8±0.2 1 1.9 0±0.3 7* 2.1 3±0.3 4* 2.4 5±0.3 9*△E組 6 1.4 0±0.2 2 2.1 1±0.1 8* 2.3 9±0.3 2* 2.8 9±0.2 9*

3 討論

經(jīng)氣管注入博萊霉素建立肺纖維化的動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用。本研究病理學(xué)改變?cè)缙诜闻菅酌黠@,第 7天開始出現(xiàn)肺纖維化,至第 28天纖維化已成為主要的病理改變。NF-κB是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子,具有廣泛的生物學(xué)活性,激活后可促進(jìn)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子等的轉(zhuǎn)錄。NF-κB與呼吸系統(tǒng)多種疾病密切相關(guān)[3]。IFN-γ是典型的 Th1類細(xì)胞因子,具有抑制成纖維細(xì)胞增生及膠原聚集等作用,并且可以拮抗 Th2類細(xì)胞因子 IL-4、TGF-β的作用。所以 IFN-γ的相對(duì)缺乏可能與纖維母細(xì)胞激活、膠原沉積和瘢痕形成有關(guān)。而 Th2細(xì)胞來源的因子如 IL-4可擴(kuò)大炎癥反應(yīng),引起肺結(jié)構(gòu)的重塑,刺激肺成纖維細(xì)胞增生,伴有膠原和纖維素沉積增多,引起肺泡壁基底膜增厚和彌漫性上皮下纖維化[4,5]。以 IFN-γ/IL-4來衡量特發(fā)性肺纖維化中 Th1/Th2之間的平衡,其細(xì)胞因子的表達(dá)呈現(xiàn)出 Th2方向的偏移狀態(tài),Th2類的強(qiáng)勢(shì)表達(dá)在特發(fā)性肺纖維化的過程中具有重要意義。這些變化與 NF-κB的活化密切相關(guān),NF-κB的活化使 IL-4表達(dá)增強(qiáng),可能是肺纖維化早期肺泡炎發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此提前干預(yù) NF-κB可能明顯減輕博萊霉素引起的急性毒性反應(yīng)。

根據(jù) Th1和 Th2細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中的中心作用,通過調(diào)節(jié) Th1/Th2平衡阻斷某些疾病的惡性循環(huán),可以為某些疾病的治療提供新的治療策略[6]。應(yīng)用 NF-κB的反義寡核苷酸可以抑制 NF-κB的活性,尤其在給予博萊霉素前應(yīng)用,可以更明顯抑制早期肺泡炎的出現(xiàn)或防止肺泡炎的持續(xù)發(fā)展,從而預(yù)防或減輕肺纖維化的產(chǎn)生。但應(yīng)用 NF-κB的反義寡核苷酸組的 NF-κB的活性仍然比對(duì)照組高,推測(cè)還可能與存在其他轉(zhuǎn)化因子有關(guān)。

綜上所述,NF-κB活化是 Th1/Th2細(xì)胞因子失衡的主要原因,干預(yù) NF-κB活化可以使 Th1/Th2細(xì)胞因子失衡得到一定程度的逆轉(zhuǎn),并可以一定程度上減輕肺纖維化的程度。

[1]Zhang XY,Shimura S,Masuda T,et al.Antisense oligonucleotides to NF-kappaB improve survival in bleomycin-induced pneumopathy of the mouse[J].Am JRespir Crit Care Med,2000,162(4 Pt 1):1561-1568.

[2]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JR,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[3]Wright JG,Christman JW.The role of nuclear factor kappa B in the pathogenesis of pulmonary diseases:implications for therapy[J].Am J Respir Med,2003,2(3):211-219.

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