衍生化分光光度法快速測(cè)定卡托普利片中主藥的含量Δ

熊正平，黃開(kāi)順，朱鏈鏈，陳志瓊

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，重慶市 400016）

卡托普利（Captopril，Cap），化學(xué)名為 1-（（2S）-2-甲基-3-巰基-1-氧代丙基）-L-脯氨酸，是第1代血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制劑藥物，對(duì)各種類(lèi)型高血壓均有明顯的降壓作用，特別是對(duì)其它降壓藥物治療無(wú)效的嚴(yán)重高血壓有很好的療效，是臨床上廣泛應(yīng)用的高血壓藥物，因此建立其制劑中主藥含量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法具有重要的意義。但是卡托普利中含有不穩(wěn)定的巰基，所以對(duì)其測(cè)定有一定難度?，F(xiàn)階段的測(cè)定方法研究很多都集中在將巰基衍生化后再進(jìn)行卡托普利的含量測(cè)定，如采用對(duì)溴苯甲酰甲基溴（p-BPB）[1，2]、5，5′-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）[3]、2，2′-二硫二吡啶（2-PDS）[4]等衍生化試劑，但它們的衍生化產(chǎn)物都不太穩(wěn)定，給測(cè)定帶來(lái)不便。本文在比較多種衍生化試劑后，采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）[5]作為衍生化試劑，結(jié)果其與卡托普利反應(yīng)后形成的產(chǎn)物很穩(wěn)定，再采用簡(jiǎn)便的分光光度法即可對(duì)其含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，結(jié)果可靠。

1 儀器與試藥

UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器公司）；HS-2D超聲波清洗器（上海新芝生物技術(shù)研究所）；旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；Elgastat UHO超純水器（英國(guó)Elga公司）。

卡托普利對(duì)照品（重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供，批號(hào)：20080104，純度：99.9%）；卡托普利片（湖北華中藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20080504、20080703、20080903，規(guī)格：每片25 mg）；DNFB、二甲基亞砜（DMSO）均為化學(xué)純，乙腈為特級(jí)純，氫氧化鈉、甲醇、乙酸乙酯及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 卡托普利貯備液。精密稱(chēng)取卡托普利對(duì)照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，使制備成濃度為1 g·L－1的貯備液。

2.1.2 衍生化試劑。DNFB經(jīng)減壓蒸餾后用乙腈配成0.05%的溶液，避光保存。

2.1.3 NaOH溶液的制備。稱(chēng)取NaOH 1 g置于250 mL的容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，使成0.1 mol·L－1的貯備液，然后再稀釋成0.01 mol·L－1的溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備。取卡托普利片20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)。精取適量（約相當(dāng)于卡托普利25 mg）置于25 mL容量瓶中，加水超聲使其溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，得續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液50 μL和DNFB 90 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，旋渦1 min后放入40℃水浴，暗處反應(yīng)45 min后用水稀釋到5 mL刻度處，搖勻，即得。

2.2 吸收光譜的制備

量取1 g·L－1的卡托普利對(duì)照品50 μL和DNFB 90 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，然后將其旋渦1 min后放入40℃水浴中暗處反應(yīng)45 min，再用水稀釋到5 mL刻度處，搖勻。以空白試劑為參比，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，同樣掃描得到卡托普利對(duì)照品、DNFB、供試品和空白輔料溶液（取不含卡托普利的片劑處方中其它輔料，按“2.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備）的吸收光譜見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜1.DNFB；2.卡托普利對(duì)照品；3.衍生反應(yīng)產(chǎn)物；4.空白輔料Fig 1 UV absorption spectrum1.2，4-dinitrofluorobenzene；2.captopril control；3.product of derivatization reaction；4.blank excipients

從圖1可知，卡托普利對(duì)照品在202 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收（曲線2），但是在紫外末端，不宜用于主藥的含量測(cè)定；而用DNFB（曲線1）衍生后使其吸收峰波長(zhǎng)增至（342±1）nm（曲線3），且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，有利于測(cè)定卡托普利片的主藥含量。同法處理卡托普利片供試品溶液和輔料，結(jié)果表明片劑中卡托普利的衍生化產(chǎn)物與對(duì)照品產(chǎn)物的吸收光譜一致；片劑輔料不與DNFB發(fā)生反應(yīng)，且在（342±1）nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收（曲線4），將不會(huì)干擾卡托普利的測(cè)定。因此，本研究以342 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 試驗(yàn)條件的考察

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)衍生化反應(yīng)的影響考察。精密量取1 g·L－1的卡托普利對(duì)照品50 μL和DNFB 50 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，然后將其旋渦1 min后分別在室溫、40℃、60℃和80℃水浴暗處反應(yīng)45 min后，用水稀釋至5 mL刻度處，搖勻，以空白試劑為參比，在342 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果分別是0.211、0.330、0.328、0.339，可見(jiàn)溫度會(huì)對(duì)衍生化反應(yīng)產(chǎn)生影響，較低的溫度不利于反應(yīng)的發(fā)生，升溫可以提高反應(yīng)產(chǎn)率，但是溫度超過(guò)40℃后反應(yīng)產(chǎn)率變化不大，所以選擇40℃水浴為反應(yīng)溫度。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的考察。反應(yīng)其他條件同“2.3.1”，旋渦1 min后放入40℃水浴暗處反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別是15、30、45、60、90、150 min，在342 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度分別是0.299、0.329、0.332、0.334、0.326、0.326，即反應(yīng)進(jìn)行45 min基本達(dá)到平衡，故本試驗(yàn)選取45 min為反應(yīng)時(shí)間。

2.3.3 DNFB的用量考察。反應(yīng)其他條件同“2.3.1”，改變衍生化試劑DNFB溶液的用量，分別加入DNFB 0、50、65、75、85、90、95、100、110 μL，在40 ℃水浴暗處反應(yīng)45 min后在342 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，分別為 0、0.325、0.397、0.412、0.420、0.424、0.416、0.410、0.415。結(jié)果表明，卡托普利與DNFB的反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，稍過(guò)量的DNFB有利于衍生化產(chǎn)物的形成，但是過(guò)量太多反而會(huì)使衍生產(chǎn)物量減少，所以DNFB選取量為90 μL。

2.3.4 NaOH溶液的用量考察。反應(yīng)其他條件同“2.3.1”，改變NaOH溶液用量，分別加入NaOH溶液0、10、20、25、30、35、40 μL，在40℃水浴暗處反應(yīng)45 min后在342 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 NaOH溶液的用量對(duì)反應(yīng)的影響Fig 2 Effect of the amount of NaOH solution on derivatization reaction

由圖2可以看出，當(dāng)NaOH溶液加到20 μL后吸光度變化不大，所以本試驗(yàn)NaOH溶液選用25 μL。

2.3.5 衍生物的穩(wěn)定性考察。反應(yīng)其他條件同“2.3.1”，在40℃水浴暗處反應(yīng)45 min后用水稀釋至5 mL時(shí)及室溫放置20、40、60、90、150 min、24 h后測(cè)定吸光度。其結(jié)果分別為0.421、0.421、0.420、0.420、0.420、0.420、0.420?？梢?jiàn)吸光度在24 h內(nèi)沒(méi)有明顯變化，所以在室溫狀況下，衍生化反應(yīng)產(chǎn)物在24 h內(nèi)都可以穩(wěn)定存在，使測(cè)定更為方便。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取7支試管，分別精密量取1 g·L－1的卡托普利對(duì)照品0、5、20、30、40、50、70 μL和DNFB 90 μL，其他操作照“2.1.4”項(xiàng)下“于10 mL的試管中”起，同法操作，以空白試劑為參比，在342 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）對(duì)卡托普利的質(zhì)量濃度（ρ）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程ρ＝25.153A－0.0916（r＝0.9999），結(jié)果表明卡托普利檢測(cè)濃度在1.0～14.0 μg·mL－1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 方法的重復(fù)性

取同一樣品5份，按“2.1.4”項(xiàng)下供試品溶液的方法操作，間隔不同時(shí)間測(cè)定吸光度，考察日內(nèi)精密度，結(jié)果RSD＝0.24%（n＝5）；取同一樣品于1周內(nèi)不同日測(cè)定吸光度考察日間精密度，結(jié)果RSD＝1.37%（n＝5），表明方法的重復(fù)性很好。

2.6 回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取卡托普利對(duì)照品適量置于25 mL容量瓶中，分別加入處方量的各種輔料，按“2.1.4”項(xiàng)下供試品溶液的方法操作，低、中、高3個(gè)濃度（每個(gè)濃度平行測(cè)定3份）下回收率計(jì)算結(jié)果如表1。

表1 回收率的測(cè)定結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.7 卡托普利片中主藥含量測(cè)定

選取3個(gè)批次的市售卡托普利片，照“2.1.4”項(xiàng)下供試品溶液的方法操作，每個(gè)批次平行測(cè)定3次，計(jì)算其主藥標(biāo)示含量，并與《中國(guó)藥典》的碘酸鉀法[6]進(jìn)行比較，結(jié)果如表2。

3 討論

表2 卡托普利片中主藥含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Content determination of the main component of Captopril tablets

《中國(guó)藥典》中[6]采用碘酸鉀法測(cè)定卡托普利片劑主藥含量時(shí)，由于其輔料大部分都是淀粉，過(guò)濾時(shí)不能全部過(guò)濾干凈或淀粉部分溶于水中使滴定終點(diǎn)提前到達(dá)，因此使測(cè)定結(jié)果很不準(zhǔn)確。經(jīng)驗(yàn)證，采用DNFB作為衍生化試劑與卡托普利反應(yīng)，使吸收峰波長(zhǎng)增至342 nm，且形成的衍生產(chǎn)物很穩(wěn)定，能更方便地測(cè)定卡托普利片劑中主藥的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定、可靠，且操作簡(jiǎn)便、快速，適用于卡托普利片劑中主藥的含量測(cè)定。

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