聚乳酸作為腦植入劑載體的安全性初步研究

唐華非，劉松青，李飛，馮華（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部，重慶市 400038；.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶市 400038）

由于血腦屏障的存在，多數(shù)藥物如化療藥、抗生素等以常規(guī)方式給藥后難以在腦內(nèi)達(dá)到有效濃度，若加大給藥量又會增加全身性毒副作用。腦植入劑作為一種新型制劑，不僅可以使化療藥物避開血腦屏障，直接作用于腫瘤組織，減少全身性毒副作用，還具有緩控釋特性，在一定時間內(nèi)使藥物能夠在病變部位維持在有效濃度。

聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）屬于脂肪族聚酯化合物，因其具有完全生物降解性和優(yōu)良的生物相容性，在1997年被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為藥用輔料，并廣泛地應(yīng)用于藥物緩控釋系統(tǒng)。筆者曾以聚乳酸作為藥物緩釋載體自制羥基喜樹堿腦植入緩釋片，已完成緩釋片的處方優(yōu)化[1]，并初步用于實(shí)驗(yàn)動物惡性腦腫瘤的研究，取得了良好效果。腦組織具有其特殊性，尤其是腦神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，被損傷后不能再生。為了解聚乳酸對神經(jīng)元和腦組織的影響，本文通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察聚乳酸對神經(jīng)元和腦組織的作用，綜合評價聚乳酸在腦內(nèi)應(yīng)用的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 試藥、儀器與動物

聚乳酸（山東省醫(yī)療器械研究所，批號：060501，分子量：20000）；自制聚乳酸空白片（直徑3 mm，厚度2 mm，60Co照射滅菌后備用）；D-Hanks、DMEM/F12培養(yǎng)基（北京Hyclone公司）；胎牛血清、馬血清（美國Gibco公司）；N3培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂抑制劑（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）單克隆抗體、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（Cell counting kid-8，CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所中國上海代表處）；Hoechst33258染液、抗熒光萃滅液、蘇木素-伊紅染液（Hematoxylin-Eosin，HE）、尼氏染液（Nissl）均由上海Beyotime公司提供。

激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

成年SD大鼠18只，♂，體質(zhì)量200～230 g；新生1 d的SD大鼠。生產(chǎn)合格證號：SCXK（軍）2002-007，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 體外試驗(yàn)方法

1.2.1 孔板預(yù)處理。聚乳酸組孔板采用溶劑揮發(fā)成膜法[2]進(jìn)行處理，即將定量的聚乳酸溶解在二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中（體積比為9∶1），然后倒入鋪有聚四氟乙烯薄膜的孔板中，待溶劑揮發(fā)完全后，加入異丙醇浸潤，脫膜后，干燥至恒重，60Co（2.0 Mrad）照射滅菌[3]，小牛皮膠包被，隔夜使用。正常對照組孔板僅用小牛皮膠包被。

1.2.2 大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)[4]。將新生1 d的SD大鼠用75%的乙醇浸泡消毒后，采用無菌方法迅速斷頭，取大腦，用D-Hanks液清洗并剔除腦膜和血管，將分離得到的大腦皮質(zhì)剪成約1 mm3大小的組織塊，用0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心（800 r·min－1，5 min）后棄去上清，加入含馬血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。計數(shù)后按每毫升106個接種于預(yù)處理的96孔培養(yǎng)板或24孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后全量換N3培養(yǎng)基[5]（DMEM/F12培養(yǎng)基+2%N3），并加入細(xì)胞分離抑制劑（5-氟-2’-脫氧尿苷15 μg·mL－1和尿苷35 μg·mL－1），作用48 h后更換新鮮培養(yǎng)液。以后每3 d半量更換培養(yǎng)液1次。

1.2.3 神經(jīng)元純度鑒定。神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)至第7天，進(jìn)行NSE染色鑒定。神經(jīng)元可被NSE特異性識別并表現(xiàn)為彌漫性胞漿染色。隨機(jī)計數(shù)500個細(xì)胞，計算NSE陽性細(xì)胞染色率。方法步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 倒置相差顯微鏡觀察。體外原代培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元生長周期較長，分別在不同時間點(diǎn)觀察聚乳酸組和正常對照組細(xì)胞的生長情況。

1.2.5 細(xì)胞毒性測定。分別在體外培養(yǎng)神經(jīng)元至第7、9、12天時利用CCK-8[6]檢測聚乳酸對神經(jīng)元的影響。該試劑中含有WST-8，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan，細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

將神經(jīng)細(xì)胞分別接種于預(yù)處理的96孔板中，每個處理組設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)不含細(xì)胞的空白對照孔。每孔加CCK-8試劑10 μL，37℃孵育2 h后，在酶標(biāo)儀上采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長490 nm，參比波長550 nm。

1.2.6 檢測聚乳酸對細(xì)胞凋亡的影響。分別將體外培養(yǎng)至第7、9、12天的神經(jīng)元用4%多聚甲醛4℃固定5 min，蒸餾水充分漂洗后，加Hoechst33258工作液染色10 min。蒸餾水漂洗后，用濾紙吸去殘留的液體，滴加少許抗熒光萃滅劑和封片劑于載玻片上，將蓋玻片的細(xì)胞面朝下進(jìn)行封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機(jī)選擇不同視野，至少計數(shù)500個細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡情況用百分率表示。

1.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠分組。將SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為聚乳酸空白片組、假手術(shù)組和正常對照組，每組6只。

1.3.2 模型制作。采用3%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射進(jìn)行麻醉，立體定向儀固定大鼠頭部，無菌開顱，以冠狀縫前3 mm，矢狀縫右側(cè)3.5 mm為中心，開直徑為3 mm的骨窗[7]，切開硬膜，取60Co照射滅菌的聚乳酸空白片植入皮層下1 mm，縫合。假手術(shù)組采用同樣方法開顱，模擬聚乳酸空白片機(jī)械損傷，剪去一定大小的皮質(zhì)后，縫合。正常對照組不作任何處理。

1.3.3 大鼠術(shù)后觀察。在術(shù)后不同時間點(diǎn)對大鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察檢測，包括飲食、行為、體質(zhì)量變化等，進(jìn)而對大鼠受損和恢復(fù)程度進(jìn)行評價分析。

1.3.4 標(biāo)本取樣及檢測。植入緩釋片后30 d，分別對大鼠實(shí)施麻醉，4%多聚甲醛全身灌注，取大腦，去除緩釋片殘片，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，10%福爾馬林溶液固定保存。HE染色后觀察神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和分布，對大腦正常組織和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。Nissl染色后觀察神經(jīng)元尼氏體受染情況，在生理情況下，尼氏體大而數(shù)量多，反映神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，在神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元純度鑒定結(jié)果

體外原代培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)NSE染色，胞漿和突起被染成棕褐色而胞核未被染色的為陽性細(xì)胞，整個細(xì)胞都未被染色的為陰性細(xì)胞。采用該方法體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元純度經(jīng)鑒定達(dá)95%以上。

2.2 倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果

神經(jīng)元接種6～12 h后開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，種植12 h后，大部分細(xì)胞貼壁呈圓形，其中少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞開始伸出1～2個突起。培養(yǎng)24 h后，伸出突起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多，突起一般長為20～40 μm。7 d后神經(jīng)元胞體大，飽滿，直徑8～12 μ m，有立體感，軸突細(xì)長均勻，直徑恒定，樹突長而多，呈網(wǎng)格狀。2組細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 2組神經(jīng)元的生長情況（×200）a.正常對照組；b.聚乳酸組Fig 1 The growth of neurons in 2 groups（×200）a.normal control group；b.PLAgroup

圖1顯示，體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元9 d后，2組神經(jīng)元胞體均比較飽滿，周圍有光暈，生長狀態(tài)良好。

2.3 聚乳酸對體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元毒性的影響

以CCK-8吸光度值為指標(biāo)測得聚乳酸對體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元毒性的影響見表1。

表1 2組不同時間點(diǎn)神經(jīng)元的CCK-8吸光度值（）Tab 1 The CCK-8 absorbance of neurons in 2 groups at different time points（）

表1 2組不同時間點(diǎn)神經(jīng)元的CCK-8吸光度值（）Tab 1 The CCK-8 absorbance of neurons in 2 groups at different time points（）

12 d 0.356±0.0070.368±0.012組別聚乳酸組正常對照組7 d 0.364±0.0140.381±0.0119 d 0.363±0.0130.375±0.020

表1顯示，各時間點(diǎn)2組兩兩比較，正常對照組CCK-8吸光度值均略高于聚乳酸組，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 聚乳酸對體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元凋亡的影響

聚乳酸對體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡的影響見表2。表2顯示，隨時間的延長，2組神經(jīng)元凋亡率均有所增加；各時間點(diǎn)2組兩兩比較，聚乳酸組致神經(jīng)元凋亡率略高于正常對照組，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 2組不同時間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率（%，）Tab 2 Apoptosis rates of neurons in 2 groups at different time points（%，）

表2 2組不同時間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率（%，）Tab 2 Apoptosis rates of neurons in 2 groups at different time points（%，）

組別聚乳酸組正常對照組12 d 4.59±0.954.50±0.987 d 3.68±2.423.64±2.219 d 4.25±2.293.88±2.86

2.5 大鼠行為能力觀察結(jié)果

術(shù)后各組大鼠活動量均減少，食物和水的消耗量降低；1 d后能正常飲食，聚乳酸空白片組較假手術(shù)組警覺性降低。在術(shù)后3 d內(nèi)聚乳酸空白片組體質(zhì)量下降較多，5 d后各組大鼠行為能力差異不明顯，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均未發(fā)生非處死性死亡。

2.6 聚乳酸空白片對大鼠腦組織的影響

各組腦組織HE染色和Nissl染色結(jié)果見圖2（A點(diǎn)指示假手術(shù)所致腦損傷；B點(diǎn)指示聚乳酸空白片所致腦組織缺損，箭頭指示小膠質(zhì)細(xì)胞增生）、圖3（圖f中箭頭指示尼氏染色的神經(jīng)元）。

圖2 各組腦組織HE染色（×200）c.正常對照組；d.假手術(shù)組；e.聚乳酸空白片組Fig 2 Brain tissue stained by HE in each group（×200）c.normal control group；d.sham-operated group；e.PLAblank tablet group

圖2為30 d后大鼠腦組織HE染色結(jié)果。與假手術(shù)組比較，聚乳酸空白片組大鼠受損腦組織處出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞增生，但神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)沒有明顯變化。圖3為30 d后大鼠腦組織的Nissl染色結(jié)果。腦組織神經(jīng)元的尼氏體著藍(lán)色，胞核淡染。與假手術(shù)組比較，聚乳酸空白片組大鼠腦組織神經(jīng)元尼氏體的數(shù)量仍維持在較高水平，差異不明顯。

上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)采用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法可以得到純度較高、活性較好、生長穩(wěn)定的大腦皮層神經(jīng)元；聚乳酸對體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用均不明顯；聚乳酸植入腦部后，腦組織有一定的炎癥反應(yīng)，但神經(jīng)元的數(shù)量和活性未受顯著影響。

3 討論

神經(jīng)元是高等動物神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)單位和功能單位。隨著腦內(nèi)靶向治療技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，越來越多的緩控釋材料被應(yīng)用于腦腫瘤的治療。作為腦植入緩釋制劑的載體，除了要具有良好的生物降解性，更重要的是對神經(jīng)元的生長和功能影響要小。本實(shí)驗(yàn)首次對聚乳酸和大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行了共培養(yǎng)，證實(shí)了聚乳酸與體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元可以長期共存，神經(jīng)元經(jīng)聚乳酸誘導(dǎo)后凋亡不明顯。

在神經(jīng)元體外培養(yǎng)過程中，前期主要是對神經(jīng)元的純化過程，神經(jīng)元也會發(fā)生部分自然死亡，7 d后存活下來的細(xì)胞數(shù)量才趨于穩(wěn)定。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，檢測神經(jīng)元活性一般選擇在培養(yǎng)至7～9 d后進(jìn)行。

聚乳酸空白片植入腦內(nèi)后，腦組織有輕微的的炎癥反應(yīng)，且略強(qiáng)于假手術(shù)組，其原因除機(jī)械損傷外，可能與聚乳酸代謝過程中產(chǎn)生的部分碎片有關(guān)[8]。尼氏染色結(jié)果顯示神經(jīng)元的數(shù)量和蛋白合成能力受影響程度不明顯，與文獻(xiàn)[7]對聚己內(nèi)酯（PCL）和聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA）生物相容性研究結(jié)果相符，聚乳酸對腦組織的損傷不明顯。對高分子材料的體內(nèi)降解研究[9]表明，PLGA被植入體內(nèi)4周時，74%以上已被降解代謝，而聚乳酸的降解要更快些，所以動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇30 d作為觀察時間點(diǎn)。

本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察聚乳酸對神經(jīng)元和腦組織的影響，初步證實(shí)聚乳酸對體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用均不顯著，對腦內(nèi)神經(jīng)組織無明顯毒性。

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