高效液相色譜熒光法測定大鼠靜脈注射桂利嗪的血藥濃度

施潔明，何仲貴（1.廣州市藥品檢驗所，廣州市 510160；.沈陽藥科大學藥學院，沈陽市 110016）

桂利嗪（Cinnarizine）為二苯哌嗪類鈣離子拮抗劑[1]，它直接擴張血管平滑肌，顯著改善腦循環(huán)和冠循環(huán)，該藥目前主要用于心絞痛及腦血循環(huán)障礙。目前，國內(nèi)、外對桂利嗪的劑型研究并不完善，《中國藥典》現(xiàn)收載的只有片劑和膠囊劑這2種口服固體制劑。而從臨床使用方面來看，注射劑起效更快、療效更好，所以有必要研究和制備桂利嗪注射劑。桂利嗪在水中幾乎不溶，而2-羥丙基-?-環(huán)糊精作為新型的注射用輔料對桂利嗪有良好的增溶作用[2]，同時避免了使用有機溶媒所導致的刺激性和毒副作用。筆者在前期成功制備桂利嗪注射劑的基礎上，以大鼠為模型動物，采用高效液相色譜熒光法測定了桂利嗪靜脈注射給藥后的血藥濃度，并研究了其在大鼠體內(nèi)的藥動學。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀、RF-10AXL熒光檢測器（日本島津公司）。

1.2 試藥

桂利嗪對照品（廣東麗珠集團利民制藥廠，批號：20030302，純度：99.2%）；內(nèi)標鹽酸氟桂利嗪（江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號：000626，純度：99.5%）；桂利嗪注射液（沈陽藥科大學藥劑教研室，批號：030508，規(guī)格：20 mg·2 mL－1）；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，200～250 g，沈陽藥科大學實驗動物室提供，動物合格證號：SCXK（遼）2003-008。

2 方法與結果

2.1 實驗方案

取大鼠6只，禁食過夜，自由飲水。頸靜脈插管給藥，劑量為3 mg·kg－1。于給藥后5、10、20、40、60、120、240 min時靜脈取血0.5 mL，肝素抗凝，4000 r·min－1離心10 min，取0.1 mL血漿備用。

2.2 色譜條件[3]

色譜柱：Diamond C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氫銨（50∶50，用磷酸調(diào)至pH至5.7）；流速：1.5 mL·min－1；柱溫：30 ℃；檢測波長：激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長315 nm；進樣量：20 μL。

2.3 對照品貯備液和內(nèi)標溶液配制

精密稱取桂利嗪對照品適量，用甲醇溶解并制成0.1 mg·mL－1貯備液；另取鹽酸氟桂利嗪適量，用甲醇溶解并制備成600 ng·mL－1的溶液作為內(nèi)標溶液。

2.4 血樣處理

取0.1 mL血漿置于10 mL具塞玻璃離心試管中，加入內(nèi)標100 μL和0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液100 μL，用渦旋混合器振蕩1 min，加入乙醚1 mL，渦旋振蕩2 min，10000 r·min－1離心5 min，收集上清液置于另一具塞玻璃離心試管中，下層液體用乙醚1 mL再提取1次，合并上清液，于40℃水浴中氮氣吹干，加入100 μL流動相，渦旋2 min，10000 r·min－1離心2 min，取20 μL進樣。

2.5 方法專屬性

取空白血漿、空白血漿+內(nèi)標+對照品、靜脈注射后血漿樣品（10 min）按“2.4”項下方法處理后進樣分析，各色譜峰分離情況見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標+對照品；C.血漿樣品；1.桂利嗪；2.內(nèi)標Fig 1 HPLC chromatographyA.blank plasma；B.blank plasma spiked with internal standard and cinnarizine control；C.plasma sample；1.cinnarizine；2.internal standard

圖1結果表明，桂利嗪與內(nèi)標之間分離良好，色譜峰形對稱，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的色譜峰很小，對桂利嗪和內(nèi)標的測定無干擾。

2.6 標準曲線的制備

將對照品貯備液制備成不同濃度，加入空白血漿中，使其在血漿中濃度分別為10、50、100、250、500、1000 ng·mL－1，按“2.4”項下操作，記錄色譜圖、樣品峰面積（As）與內(nèi)標峰面積（Ai）。以R＝As/Ai計算不同濃度的R值，用R對血藥濃度C進行線性回歸，得標準曲線方程R＝0.0023C+0.0269（r＝0.9996）。結果表明，桂利嗪檢測濃度線性范圍為10～1000 ng·mL－1。按信噪比為3∶1，最低檢測限為0.2 ng·mL－1。

2.7 提取回收率試驗

取空白血漿制備含桂利嗪分別為20、500、1000 ng·mL－1的血漿對照樣品，每個濃度平行配制5份，按“2.4”項下操作，以提取后的色譜峰面積與同濃度溶液直接進樣所得的峰面積之比作為提取回收率。結果，提取回收率分別為95.9%、98.2%、98.6%，RSD分別為1.5%、1.1%、3.2%。取內(nèi)標溶液100 μL加入到0.1 mL空白血漿中，制備5份，按“2.4”項下操作，以提取后的色譜峰面積與同濃度內(nèi)標溶液直接進樣所得的峰面積之比作為內(nèi)標提取回收率。結果，內(nèi)標提取回收率為96.3%，RSD＝1.8%。

2.8 精密度試驗

取空白血漿制備含桂利嗪分別為20、500、1000 ng·mL－1的血漿對照樣品，按“2.4”項下操作進行分析測定，連續(xù)測定3 d。結果日內(nèi)精密度RSD分別為5.4%、4.7%、6.8%，日間精密度RSD分別為5.1%、3.6%、8.6%。表明日內(nèi)、日間精密度均符合生物樣品分析的要求（RSD＜15%）。

2.9 血漿樣品的穩(wěn)定性考察

制備濃度分別為20、500、1000 ng·mL－1的桂利嗪血漿樣品數(shù)份，室溫放置10 h后按“2.4”項下方法處理后測定，計算桂利嗪濃度。結果3個濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在室溫條件下10 h內(nèi)穩(wěn)定。將上述3個濃度的血漿樣品冰凍貯藏，并分別于10、20、30 d取出解凍，按“2.4”項下方法處理后測定。結果3個濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在冰凍條件下30 d穩(wěn)定。另取冰凍貯藏后的3個濃度血漿樣品，室溫融化，重復凍融3次，按“2.4”項下方法處理后測定。結果3個濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在凍融過程中穩(wěn)定。

2.10 血藥濃度及藥動學結果

大鼠給藥后桂利嗪平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 靜脈注射給藥后桂利嗪平均血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of cinnarizine after intravenous injection（n＝6）

根據(jù)消除相末端直線部分的斜率計算t1/2，AUC0～240min由梯形法求得。結果t1/2為（87.73±22.54）min，AUC0～240min為（58453±8672.8）ng·min·mL－1。

3 討論

3.1 內(nèi)標物的選擇

本文首次采用鹽酸氟桂利嗪作為內(nèi)標物來測定桂利嗪的血藥濃度，兩者性質(zhì)和結構均相似，保留時間相近，在本文實驗條件下10 min內(nèi)可獲得良好的分離度，且桂利嗪和內(nèi)標的色譜峰形均令人滿意。

3.2 檢測器的選擇

桂利嗪的給藥劑量較小，為每日20 mg，所以血藥濃度較低，在紫外檢測器下響應值較小，藥物進入血液后很快就被消除因而無法檢出，以至于無法獲得完整的實驗數(shù)據(jù)。筆者利用桂利嗪和內(nèi)標均具有熒光的特點，選用熒光檢測器來提高檢測的靈敏度。結果表明，本實驗建立的熒光檢測法靈敏度高，最低檢測限為0.2 ng·mL－1。

3.3 血漿處理條件的選擇

筆者曾選用正己烷[4]、氯仿、乙酸乙酯[5]、乙醚等提取溶劑，發(fā)現(xiàn)前2種溶劑提取時易發(fā)生乳化現(xiàn)象，乙酸乙酯提取后內(nèi)源性雜質(zhì)較多，對測定有干擾。本文首次采用乙醚作為提取溶劑，結果未發(fā)生乳化現(xiàn)象，且選擇性強、操作簡便、毒性較小、提取回收率高且穩(wěn)定，是桂利嗪體內(nèi)藥物分析較好的方法。

[1]孫定人，張石革，梁三江.國家臨床新藥集[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001：230～231.

[2]施潔明，何仲貴，劉曉紅，等.2-羥丙基-β-環(huán)糊精對桂利嗪的增溶作用[J].中國新藥雜志，2004，13（3）：233.

[3]李 揚，王 威，劉 蕾，等.鹽酸氟桂利嗪片人體生物等效性研究[J].中國藥房，2000，11（3）：120.

[4]劉玉旺，孫培紅，趙 俠，等.氟桂利嗪膠囊的人體生物等效性研究[J].中國臨床藥理學雜志，2001，17（4）：277.

[5]湯麗芬，吳玨珩，李莉春，等.用反相高效液相色譜法測定人體血漿中鹽酸氟桂利嗪含量[J].分析測試學報，2000，19（6）：75.