硒化殼聚糖對HL60細胞的誘導分化作用

鄧守恒，李程，楊君君，邱美紅，吳松松，陳萍（1.鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院，十堰市 44000；.鄖陽醫(yī)學院，十堰市 44000）

硒化殼聚糖[1]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備而成的一種有機硒，可有效克服無機硒不易被細胞吸收、活性和毒性范圍較窄、致死量相對較小等缺點[2]，目前正對其抗腫瘤作用進行研究。硒和砷屬同族，而砷（三氧化二砷）在臨床上早已做為一種抗早幼粒白血病藥物使用，故推導硒化殼聚糖可能也具有抗早幼粒白血病的作用，且毒副作用應該比無機硒和砷小得多。本試驗即以人早幼粒白血病細胞株HL60為靶細胞，觀察硒化殼聚糖對其產生的誘導分化作用并探討了可能的作用機制，為硒化殼聚糖用于治療人早幼粒白血病奠定基礎。

1 材料

1.1 試藥

硒化殼聚糖（由福建醫(yī)科大學藥化系合成，經(jīng)中科院福建物質結構所檢測，批號：100601-200518，含硒量：0.4%）；佛波酯（TPA）、硝基藍四氮唑（NBT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國Sigma公司產品；鼠抗人c-myc單抗、羊抗鼠異硫氰酸鹽FITC-IgG二抗，兔抗人c-fos多抗、羊抗兔異硫氰酸鹽FITC-IgG二抗均購自美國Santa Cruze公司。

1.2 細胞

人早幼粒細胞性白血病細胞株HL60細胞由福建省血液病研究所提供。

1.3 儀器

Epics Elite ESP型流式細胞儀（美國Coulter公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取HL60細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU·mL－1青霉素、100 IU·mL－1鏈霉素和2 IU·mL－1谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基內，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞接種24 h后即處于指數(shù)生長期。

2.2 NBT還原法檢測硒化殼聚糖對HL60細胞的誘導分化作用[3]

取HL60細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，接種濃度為每毫升2×105個。給藥組分別加入1 mL由培養(yǎng)液制備成的50、100、200 mg·L－1硒化殼聚糖應用液，使其終濃度分別達到25、50、100 mg·L－1；空白對照組加入1mL培養(yǎng)液；每孔總體積為2 mL，并設1.4%DMSO為陽性對照組。培養(yǎng)48 h后，光鏡下觀察各組細胞形態(tài)改變，取藥物處理后的細胞懸液離心（1000 r·min－1）3 min，棄上清液，往細胞沉淀中加入0.5 mL NBT反應液（NBT0.2%，TPA以磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑制備成濃度600 ng·mL－1），37 ℃孵育1 h，加入冰冷PBS終止反應，離心（1000 r·min－1）3 min，棄上清液，制備細胞涂片，瑞氏染液染色1 min，自來水沖洗晾干后油鏡下觀察，細胞內染有藍色顆粒者為NBT陽性細胞。試驗重復4次。

2.3 分化相關蛋白c-myc和c-fos檢測[3]

收集經(jīng)不同濃度藥物處理一定時間后的HL60細胞2.5×106個，用PBS洗2次后，加1 mL預冷（4℃）70%乙醇固定，－20℃保持12 h以上。用前離心去除固定液，PBS洗2次，調節(jié)細胞濃度為每毫升1.5×106個。各取200 μL此細胞懸液，分別加入1∶100稀釋的鼠抗人c-myc單抗200 μL，37℃孵育30 min，PBS洗2次，棄上清液，再分別加入1∶100稀釋的羊抗鼠FITC-IgG二抗150 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗2次，于流式細胞儀上檢測，并得出c-myc陽性表達率（陽性表達率＝FITC對數(shù)值/檢測細胞數(shù)×100%）；c-fos檢測細胞培養(yǎng)、分組同c-myc檢測，分別加入1∶200稀釋的兔抗人c-fos多抗200 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，棄上清液，再加入1∶100稀釋的羊抗兔FITC-IgG二抗150 μL，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，于流式細胞儀上檢測其陽性表達率。

2.4 統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 硒化殼聚糖對HL60細胞分化的影響

空白對照組、硒化殼聚糖50 mg·L－1組及陽性對照組細胞光鏡下觀察結果見圖1。

由圖1可見，對空白對照組比較，硒化殼聚糖組形態(tài)上有趨向成熟分化的特征，表現(xiàn)為細胞密度較小，且細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞體積變小，胞漿增多，核縮小，核漿比例減少，細胞核由圓、橢圓轉變?yōu)槟I形、桿狀、分葉，分類計數(shù)結果顯示成熟的細胞主要為中幼粒細胞，晚幼粒細胞和桿狀核細胞少于5%，這與陽性對照組結果很相似；同時細胞內藍色顆粒增多，數(shù)量低于陽性對照組。

圖1 各組細胞分化光鏡下觀察結果a.空白對照組；b.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；c.陽性對照組Fig 1 Differentiation of HL60 cell under light microscope of each groupa.blank control group；b.50 mg·L－1selenium chitosan group；c.positive control group

3.2 分化相關蛋白檢測結果

各組分化相關蛋白c-myc檢測結果見圖2，c-fos檢測結果見圖3，定量結果見表1。

圖2 各組細胞c-myc陽性表達情況a.空白對照組；b.硒化殼聚糖25 mg·L－1組；c.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；d.硒化殼聚糖100 mg·L－1組；e.陽性對照組Fig 2 Protein expression of c-myc in cell of each groupa.blank control group；b.25 mg·L－1selenium chitosan group；c.50 mg·L－1selenium chitosan group；d.100 mg·L－1selenium chitosan group；e.positive control group

圖3 各組細胞c-fos陽性表達情況a.空白對照組；b.硒化殼聚糖25 mg·L－1組；c.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；d.硒化殼聚糖100 mg·L－1組；e.陽性對照組Fig 3 Protein expression of c-fos in cell of each groupa.blank control group；b.25 mg·L－1selenium chitosan group；c.50 mg·L－1selenium chitosan group；d.100 mg·L－1selenium chitosan group；e.positive control group

流式細胞儀分析顯示，硒化殼聚糖對HL60細胞c-myc基因表達有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），同時可增強c-fos基因的表達（P＜0.05，P＜0.01）。與空白對照組相比，經(jīng)不同濃度的硒化殼聚糖作用48 h后，HL60細胞c-myc蛋白表達水平下降了26.2%～61.3%，c-fos蛋白表達水平則提高了42%～140%。

表1 各組細胞c-myc和c-fos表達陽性率結果（n＝6）Tab 1 Positive expression rate of c-myc and c-fos molecules in cell of each group（n＝6）

4 討論

硒是人和動物體內必需的微量元素之一，大量的流行病學調查和體內、外實驗都已證實硒對包括血液病在內的多種腫瘤都具有顯著的預防和治療作用[4]。然而常用的無機補硒劑如亞硒酸鈉雖然含硒量高，但具有不易被細胞吸收、活性和毒性范圍較窄、半數(shù)致死量（LC50）相對較小，以及蓄積性毒性和致突變作用、使用時劑量難以控制等缺點而應用受限。硒化殼聚糖是有機硒，可克服無機硒的上述缺點，理論上應該比無機硒具有更強的抗腫瘤作用，且毒副作用應該小得多。

HL60細胞可在多種分化誘導物的作用下分化為中性粒細胞或巨噬細胞，其中DMSO可誘導其沿粒系途徑分化成熟[5]，在誘導HL60細胞向正常細胞方向分化成熟過程中，糖代謝活躍，代謝產物大量釋放氫，氫能將無色染料NBT還原沉淀于胞質內，呈藍黑色顆粒，這種細胞即為NBT還原陽性細胞，是細胞分化成熟的重要標志。本研究結果顯示，HL60細胞經(jīng)25、50、100 mg·L－1硒化殼聚糖或1.4%DMSO處理48 h后，細胞在形態(tài)上出現(xiàn)了趨向粒系成熟分化的特征，尤其以50 mg·L－1硒化殼聚糖組最明顯，同時也逐步具有了成熟細胞還原NBT的功能，但作用弱于1.4%DMSO組，由此提示，50 mg·L－1左右濃度的硒化殼聚糖有誘導HL60細胞沿“粒系”成熟方向分化的作用。

既往研究[6]表明，許多誘導分化劑誘導腫瘤細胞分化是由于某些癌基因表達的抑制、失活或活化所致。其中c-myc基因編碼的核蛋白可影響和調控細胞的增殖與分化，其過度表達使大量G1期細胞提前進入S期，從而促進細胞增殖、抑制細胞分化，導致細胞惡性轉化和腫瘤形成，而其表達下降則與腫瘤細胞的形態(tài)改變和分化密切相關，當HL60細胞受誘導分化劑作用向成熟粒細胞或單核細胞分化時，c-myc的表達減弱。c-fos基因主要分布在胞漿中，在成熟的粒細胞和單核細胞中高度表達，在未分化的人早幼粒細胞中卻不表達。分化誘導劑誘導此類細胞向成熟細胞分化時，c-fos基因表達明顯增強，因此認為c-fos基因是細胞分化的標志[7]。本結果顯示，經(jīng)硒化殼聚糖作用后的HL60細胞c-myc蛋白表達下降，c-fos蛋白表達升高，此結果與大多數(shù)分化誘導劑的作用相似[8]。因此，硒化殼聚糖可能通過調控增殖、分化相關基因c-myc和c-fos表達來促進HL60細胞分化，硒化殼聚糖的藥用價值值得進一步研究。

[1]鄧守恒，孫各琴，陳崇宏，等.硒化殼聚糖對NB4細胞的周期阻斷及與阿霉素的協(xié)同作用[J].中國藥房，2007，18（10）：741.

[2]李柱來，林 媚，王 晶，等.硒化殼聚糖的制備及其表征[J].海峽藥學，2005，17（3）：10.

[3]Dimberg A，Bahram F，Karlberg I，et al.Retinoic acidinduced cell cycle arrest of human myeloid cell lines is associated with sequential down-regulation of c-myc and cyclin E and posttranscriptional up-regulation of p27Kip1[J].Blood，2002，99（6）：2199.

[4]Schrauzer GN.Effects of selenium and low levels of lead on mammary tumordevelopmentand growth in MMTV-infected female mice[J].Biol Trace Elem Res，2008，25（3）：268.

[5]Bondner AJ，Ting RC，Gallaghar R，et al.Induction of human promyelocytic leukemia cells（HL-60）by nucleosides and methotrexate[J].J Cancer Inst，1981，67（5）：1025.

[6]陳 琳.原癌基因c-myc和白血病[J].福建醫(yī)科大學學報，2000，34（2）：202.

[7]Deshpande RV，Moore MA.G-CSF receptor-mediated up-regulation of c-fos but not c-caf mRNA expressionin myeloid cells[J].Mol Cell Biochem，1998，178（6）：47.

[8]Pan Q，Simpson RU.C-myc intron element-binding proteins are required for 1，25-dihydroxyvitamine D3 regulation of c-myc during HL-60 cell differentiation and the involvement of HOXB4[J].J Biochem，1999，274（13）：8437.