川芎化學(xué)成分分離鑒定與藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定Δ

張 玲，劉友平，李旻，李惠勇，范婧嫻

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都市 611137）

川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、微苦，性溫，有活血化瘀、理氣止痛等功效，常用于頭痛及瘀血證的治療。其化學(xué)成分研究國(guó)內(nèi)、外報(bào)道較多，主要有揮發(fā)油、生物堿、酚（酸）性成分等[1～3]。藁本內(nèi)酯作為川芎中主要有效成分，現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，具有抗血小板聚集、松弛子宮和氣管平滑肌、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等活性[4，5]，在川芎中可達(dá)1%以上[6]，在川芎揮發(fā)油中達(dá)30%以上[7]。因此，藁本內(nèi)酯可作為川芎藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分之一。筆者建立了川芎中藁本內(nèi)酯分離方法，并建立了其含量測(cè)定方法以用于川芎藥材的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

SGW-4型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Bruker Avance 600型核磁共振（NMR）儀（瑞士Bruker公司）；Nicolet FTMS-2000型質(zhì)譜（MS）儀（美國(guó)Nicolet公司）；LC-10A型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；CLASS-VP工作站（日本島津公司）；SPD-10A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；ΜV-Vis 8500型紫外-可見(jiàn)分光光度（UV）計(jì)（無(wú)錫科達(dá)公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；BUG25-12型超聲波清洗機(jī)（25 kHz，500 W，上海必能信超聲波有限公司）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

柱色譜硅膠（100～200目、300～400目，青島海洋化工廠(chǎng)）；甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；其它試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)）；10份川芎藥材樣品分別收集于四川都江堰徐渡鄉(xiāng)川芎中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）基地及西南藥都市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳新副教授鑒定均為川芎L.chuanxiong Hort.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

川芎粗粉1.5 kg經(jīng)乙醇滲漉提取得提取物120 g；提取物50 g經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶1，8∶2）梯度洗脫和石油醚（30～60℃）-乙醚（9∶1）洗脫得化合物1（150 mg）、2（15 mg）和3（88 mg），結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式A.化合物1；B.化合物2；C.化合物3Fig 1 Structural formula of compounds 1～3A.compound 1；B.compound 2；C.compound 3

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1 淺黃色油狀物，略有酯香味；UV λmax nm：207、283、320；（電子轟擊離子源（EI）-MS）：m/z 190（M+），161（基峰），148，133，120，106，78，55。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.96（3H，t，J＝0.75，H-11），1.50（2H，m，H-10），2.38（2H，q，J＝7.5，H-9），2.46（2H，m，H-5），2.60（2H，t，J＝9.6，H-4）），5.23（1H，t，J＝7.8，H-8），6.01（1H，m，H-6），6.28（1H，d，J＝9.6，H-7），以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道的Z-藁本內(nèi)酯（Z-ligustilide）相符。

2.2.2 化合物2 白色片狀結(jié)晶（石油醚-乙酸乙酯），mp：134～136 ℃，NMR光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，與文獻(xiàn)[2，10]報(bào)道的Z-6，8′，7，3′-二聚藁本內(nèi)酯（Z-6，8′，7，3′-diligustilide）相符。

2.2.3 化合物3 白色粉末，mp：124～126℃，NMR光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，與文獻(xiàn)[2，10]報(bào)道的Z，Z′-6，6′7，3′a-二聚藁本內(nèi)酯（Z，Z′-6，6′7，3′a-diligustilide）相符。

表1 化合物2、3的1H（600 MHz）、13C-NMR（600 MHz）數(shù)據(jù)（CDCl3）Tab 1 The1H（600 MHz）and13C-NMR（600 MHz）data of compounds 2 and 3（CDCl3）

2.3 川芎藥材中藁本內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：HypersiL ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm。在此色譜條件下，川芎藥材中藁本內(nèi)酯與其它組分能達(dá)到基線(xiàn)分離。色譜見(jiàn)圖2。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品約60 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（2.42 mg·mL-1），精密量取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密閉，稱(chēng)重，超聲提取45 min，取出，稱(chēng)重，加甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖2 高效液相色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.供試品；a.Z-藁本內(nèi)酯Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.teat sample；a.Z-ligustilide

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.2、0.5、1、1.5、2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10μL，分別進(jìn)樣測(cè)定。以藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量（X，μg）對(duì)峰面積積分值（A）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程A＝2167715X+116629（r＝0.9998）。結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.484～4.84 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好，

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液于棕色瓶中，密閉、室溫貯藏，于0、2、6、12、24 h 進(jìn)樣2次，測(cè)定藁本內(nèi)酯的峰面積。結(jié)果，RSD分別為0.38%、0.86%（n＝5），表明藁本內(nèi)酯在該溶液中穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末6份，照“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算藁本內(nèi)酯的含量。結(jié)果，RSD＝1.89%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知藁本內(nèi)酯含量的川芎藥材粉末約0.25 g，6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL和甲醇10 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別測(cè)定藁本內(nèi)酯的含量。結(jié)果，平均回收率為96.27%，RSD＝2.3%（n＝6）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取川芎樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定2次，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次川芎藥材中藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab 2 Mass ratio of ligustilide in different batches of L.chuanxiong

3 討論

由于川芎中揮發(fā)油類(lèi)成分在室溫條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生脫氫、氧化等反應(yīng)，故本試驗(yàn)采用乙醇滲漉、低沸程溶劑洗脫分離，條件溫和，經(jīng)濟(jì)高效，能使川芎中揮發(fā)性成分不被破壞，得到較好的分離。

藁本內(nèi)酯在川芎藥材中含量較高，藥理作用明確，但因其在室溫條件下穩(wěn)定性較差，是否能作為川芎含量測(cè)定指標(biāo)成分尚存在爭(zhēng)議。本試驗(yàn)以分離自制的藁本內(nèi)酯為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了HPLC含量測(cè)定方法，對(duì)所收集的10批次藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，按藥材中所含水分10%計(jì)，暫定標(biāo)準(zhǔn)為：川芎藥材中藁本內(nèi)酯含量以干燥品計(jì)不低于7.0%。

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