正交試驗(yàn)優(yōu)選乙肝寧顆粒的澄清工藝Δ

顏紅，夏新華，謝安，嚴(yán)建業(yè)，徐學(xué)云，朱麗，歐金秀，王艷平，熊飛燕（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙市 4008；.湖南九芝堂股份有限公司，長沙市 40008）

·中藥工藝與制劑·

正交試驗(yàn)優(yōu)選乙肝寧顆粒的澄清工藝Δ

顏紅1＊，夏新華1#，謝安2，嚴(yán)建業(yè)1，徐學(xué)云2，朱麗2，歐金秀2，王艷平1，熊飛燕1（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙市 410208；2.湖南九芝堂股份有限公司，長沙市 410008）

目的：優(yōu)選ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒的純化工藝。方法：采用正交試驗(yàn)法對影響絮凝效果的主要因素進(jìn)行優(yōu)選，并與醇沉工藝進(jìn)行比較。結(jié)果：采用ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝的芍藥苷保留率高，且可改善干膏粉的吸濕性。其最佳澄清條件為藥液濃度1∶7，攪拌速度350 r·min-1，80℃加入B組分0.4 mL·g-1，60℃再加入A組分0.2 mL·g-1。結(jié)論：ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝可用于乙肝寧顆粒的純化。

乙肝寧顆粒；ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑；ZTC1+1-Ⅲ型澄清劑；醇沉工藝；正交試驗(yàn)

乙肝寧顆粒是由黃芪、白芍、茵陳、黨參、制何首烏、丹參、茯苓等13味中藥組成的復(fù)方，具有調(diào)氣健脾、清熱利膽、活血化瘀之功效。臨床上主要用于治療慢性遷延性及慢性活動(dòng)性肝炎等癥。該制劑原生產(chǎn)工藝采用醇沉法除雜，但此工藝需要耗費(fèi)大量的乙醇，成本較高，易造成有效成分的流失，且制得的干浸膏粉吸濕性較強(qiáng)。本試驗(yàn)采用ZTC1+1天然澄清技術(shù)對乙肝寧顆粒的純化工藝進(jìn)行研究，并以固形物保留率、芍藥苷保留率、干浸膏粉的吸濕性為評價(jià)指標(biāo)，與醇沉法進(jìn)行比較，為乙肝寧顆粒純化工藝的改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀、Waters 2487型紫外檢測器、Breez工作站（美國Waters公司）；UV-265型分光光度儀（日本島津公司）；800型離心沉淀器（長沙市科偉儀器廠）；DF101-S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200320）；ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ天然澄清劑（天津漢威斯特科技開發(fā)有限公司）；乙肝寧水提濃縮液（湖南九芝堂股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 澄清劑的制備

2.1.1 ZTC1+1-Ⅱ澄清劑的制備取ZTC1+1-Ⅱ澄清劑A組分適量，先用少量蒸餾水?dāng)嚦珊隣睿缓蠹尤胄枰康恼麴s水，溶脹24 h，攪勻，即得1%A組分黏膠液。取澄清劑B組分適量，用少量1%醋酸溶解并攪成糊狀，加入足夠量的1%醋酸，溶脹24 h，攪勻，即得1%B組分黏膠液。

2.1.2 ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的制備取ZTC1+1-Ⅲ澄清劑A、B組分，同“2.1.1”項(xiàng)下方法制備。

2.2 樣品溶液的測定

2.2.1 固形物保留率的測定分別取純化前、后的樣品溶液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，稱重，計(jì)算固形物保留率（固形物保留率＝純化后的固形物質(zhì)量/純化前的固形物質(zhì)量×100%）。

2.2.2 吸光度的測定取樣品溶液適量，以蒸餾水為空白，于720 nm波長處測定吸光度，即得。

2.2.3 芍藥苷含量的測定（1）色譜條件：色譜柱為Prodigy C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），檢測波長為230 nm，流速為1 mL·min-1，柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)＞3 000。（2）對照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積積分值。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，芍藥苷進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝7.61×102X－9.88×103（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。（3）供試品溶液的制備與測定：精密量取樣品溶液適量，用0.45 μm微孔薄膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液適量，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒的澄清條件的優(yōu)選[1～3]

2.3.1 澄清劑A、B二組分加入順序的確定經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的A、B二組分加入順序均為先加入B組分，后加入A組分。

2.3.2 澄清劑對水提液的純化處理取一定濃度的乙肝寧水提濃縮液100 mL，置于250 mL燒杯中，于磁力攪拌器上加熱恒溫至一定溫度，在一定攪拌速度下先加入一定量的B組分，每隔30 min攪拌1次，2 h后在一定溫度和攪拌速度下加入一定量A組分，再升高至一定溫度，保溫10～15 min，最后靜置30 min再攪拌1次。靜置6 h后取出，離心抽濾，得濾液。

2.3.3 單因素考察澄清劑加入量等因素對絮凝效果的影響

按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，通過單因素對比試驗(yàn)考察澄清劑加入量、藥液濃度、溫度和攪拌對絮凝效果的影響。結(jié)果表明，ZTC1+1-Ⅱ澄清劑用于乙肝寧顆粒水提液澄清時(shí)，每1 g生藥量藥液中B組分加入量為0.4 mL，A組分加入量為0.2 mL時(shí)，沉淀為顆粒狀，濾液吸光度低；藥液濃度對絮凝工藝的影響顯著，當(dāng)藥液濃度為1∶7時(shí)，沉淀完全，濾液吸光度低；A、B組分的加入溫度分別以80、60℃為宜；攪拌速度為350 r·min-1時(shí)，濾液吸光度低。ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒水提液澄清時(shí)，每1 g生藥量藥液中B組分加入量為0.6 mL，A組分加入量為0.3 mL時(shí)，沉淀為顆粒狀，濾液吸光度低；藥液濃度為1∶9時(shí)，濾液吸光度低，但考慮到1∶9時(shí)濃度太小，不適合生產(chǎn)應(yīng)用，故藥液濃度可選擇1∶ 5；絮凝溫度為60、40℃，70、50℃時(shí)，濾液吸光度差別不大，故A、B組分的加入溫度以60、40℃為宜；攪拌速度為200 r·min-1時(shí)，濾液吸光度低。

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑絮凝澄清的最佳工藝在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇藥液濃度（A）、攪拌速度（B）、澄清劑加入量（C）3個(gè)對絮凝澄清效果影響較大的因素作為正交試驗(yàn)的考察因素，并以吸光度、固形物保留率及芍藥苷的含量作為評價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表安排試驗(yàn)。ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝因素水平見表 1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表 2；方差分析結(jié)果見表3、表4、表5。

表1 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝因素水平Tab 1 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅱclarification technology

表2 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of ZTC1+1-Ⅱclarification technology in orthogonal experiment

由表1～表5可知，影響澄清效果的因素大小依次為A＞B＞C；方差分析表明A、C對澄清效果均有顯著性影響，而B因素的影響則不顯著。結(jié)合前面單因素對比試驗(yàn)結(jié)果，確定ZTC1+1-Ⅱ最佳澄清工藝條件為A2B2C2，即取濃度為1∶7的藥液，在80℃及350 r·min-1的攪拌條件下加入B組分0.4 mL· g-1，然后每隔30 min攪拌1次，2 h后在60℃及350 r·min-1的攪拌條件下加入A組分0.2 mL·g-1，攪拌10 min，升高溫度至80℃，保溫10 min，最后靜置30 min再攪拌1次，靜置6 h后離心抽濾，即得。

表3 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝吸光度方差分析結(jié)果Tab 3 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表4 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝固形物保留率方差分析結(jié)果Tab 4 Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝因素水平見表 6；正交試驗(yàn)結(jié)果見表 7；方差分析結(jié)果見表8、表9、表10。

由表6～表10可知，影響澄清效果的因素大小依次為A＞B＞C；方差分析表明A因素對澄清效果有顯著性影響，而B、C因素的影響則不顯著。結(jié)合前面單因素對比試驗(yàn)結(jié)果，確定ZTC1+1-Ⅲ最佳澄清工藝條件為A2B3C2或A2B2C2，即取濃度為1∶5的藥液，在60℃及200～250 r·min-1的攪拌條件下加入B組分0.6 mL·g-1，然后每隔30 min攪拌1次，2 h后在40℃及200～250 r·min-1的攪拌條件下加入A組分0.3 mL·g-1，攪拌20 min，升高溫度至80℃，保溫15 min，最后靜置30 min再攪拌1次，靜置6 h后離心抽濾，即得。

表5 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝芍藥苷含量方差分析結(jié)果Tab 5 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表6 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝因素水平Tab 6 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅲclarification technology

2.4 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ絮凝澄清工藝與醇沉工藝的比較

表7 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 7 Results of ZTC1+1-Ⅲclarification technology in orthogonal experiment

表8 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝吸光度方差分析結(jié)果Tab 8 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表9 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝固形物保留率方差分析結(jié)果Tab 9Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表10 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝芍藥苷含量方差分析結(jié)果Tab 10 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

2.4.1 醇沉處理液與ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑處理液的制備取濃度為3∶1的乙肝寧濃縮液100 mL，加乙醇使含醇量達(dá)55%，攪勻，靜置24 h，濾過，得醇沉處理液。取濃度為1∶7的乙肝寧藥液280 mL（含生藥量40 g），加入B組分16 mL、A組分8 mL，按上述優(yōu)選的工藝條件制備，濾過，得ZTC1+1-Ⅱ澄清劑的處理液。取濃度為1∶5的乙肝寧藥液200 mL（含生藥量40 g），加入B組分24 mL、A組分12 mL，按上述優(yōu)選的工藝條件制備，濾過，得ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的處理液。

2.4.2 固形物保留率、芍藥苷保留率的比較取以上3種純化工藝的處理液，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。3種純化工藝的固形物保留率與芍藥苷保留率比較結(jié)果見表11。

2.4.3 干膏粉吸濕性的比較取上述3種純化工藝處理后的干浸膏粉適量，置五氧化二磷干燥器內(nèi)干燥48 h至恒重。將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫24 h，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對濕度為75%。在已恒重的稱量瓶底部放入厚約2 mm的干膏粉，準(zhǔn)確稱重后置于上述玻璃干燥器內(nèi)（稱量瓶蓋打開）于25℃恒溫培養(yǎng)箱貯藏，定時(shí)（6、12、24、36、48、60、72 h）稱量，計(jì)算吸濕百分率。3種純化工藝的干膏粉吸濕曲線見圖1。

表113 種純化工藝的固形物保留率與芍藥苷保留率比較結(jié)果（n＝3）Tab11Comparisonofretentionrateofsolidsand paeoniflorin among 3 kinds of clarification technology（n＝3）

圖13 種純化工藝的干膏粉吸濕曲線Fig1Hygroscopic curves of powder of 3 kinds of clarification technology

3 討論

目前，絮凝澄清法替代傳統(tǒng)的醇沉法用于中藥制劑的純化工藝已有較多的研究報(bào)道。研究表明[4～6]，ZTC1+1絮凝澄清法具有生產(chǎn)安全、周期短、生產(chǎn)成本低、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)。

對乙肝寧顆粒澄清工藝的研究表明，ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+ 1-Ⅲ純化工藝的固形物保留率高于醇沉工藝，對主要有效成分芍藥苷的保留率及干浸膏粉的吸濕性方面均優(yōu)于醇沉工藝，且以ZTC1+1-Ⅱ純化工藝為佳，表明ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝可用于乙肝寧顆粒的純化。

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Optimization of the Clarification Technology of Yiganning Granules by Orthogonal Experiment

YAN Hong，XIA Xin-hua，YAN Jian-ye，WANG Yan-ping，XIONG Fei-yan（School of Pharmacy，Hunan University of TCM，Changsha 410208，China）
XIE An，XU Xue-yun，ZHU Li，OU Jin-xiu（Hunan Jiuzhitang Co.，Ltd.，Changsha 410008，China）

OBJECTIVE：To optimize the clarification technology of Yiganning granules by ZTC1+1-Ⅱand ZTC1+1-Ⅲclearing agent.METHODS：Orthogonal experiment was applied to optimize the influence factors of flocculation effect and compared with alcohol precipitation technology.RESULTS：Retention rate of peoniflorin in ZTC1+1-Ⅱclarification technology was high and improve the hygroscopicity of powder.The optimal conditions were as follows：extracting solution concentration was 1∶7，the whisking speed was 350 r·min-1；0.4 mL·g-1B was added into solution at 80℃，then 0.2 mL·g-1A was added into solution at 60℃.CONCLUSION：ZTC1+1-Ⅱclarification technology can be used to purify Yiganning granules.

Yiganning granules；ZTC1+1-Ⅱclearing agent；ZTC1+1-Ⅲclearing agent；Alcohol precipitation technology；Orthogonal experiment

R 283；R97

A

1001-0408（2010）15-1364-04

2009-05-12

2009-10-25）

Δ國家科技攻關(guān)計(jì)劃課題（2001BA701A48）

＊講師。研究方向：中藥制劑新技術(shù)與新劑型。E-mail：yh-8632@126.com

＃通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：中藥制劑新技術(shù)與新劑型。電話：0731-8458305。E-mail：xiaxinhua001@163.com