可注射美洛昔康溫敏凝膠的研制

陳敏燕，吳飛華，潘九英，金芝貴

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海市 200011）

溫敏性凝膠是一類溫度響應(yīng)型的智能凝膠材料，可以感知溫度的變化而產(chǎn)生功能性的效應(yīng)。溫敏性凝膠材料由于具備原位凝膠的特性，被應(yīng)用于藥物傳遞[1]、組織工程、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

美洛昔康通過選擇性地抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）而阻止具有致炎作用的前列腺素等的合成，具有消炎、解熱和鎮(zhèn)痛的作用。臨床主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疼痛性骨關(guān)節(jié)炎的治療[2]，但腹痛和消化不良是其最常見的不良反應(yīng)[3]。為了減輕美洛昔康帶來的胃腸道刺激性，并減少給藥次數(shù)和獲得穩(wěn)定的血藥濃度，筆者以殼聚糖-甘油-硼砂為載體，研制了具有緩釋性能的可注射美洛昔康溫敏凝膠，用于關(guān)節(jié)腔注射給藥，使其在作用部位直接且平穩(wěn)地發(fā)揮藥效，本文對(duì)該制劑的制備方法等介紹如下。

1 儀器與試藥

TV1800紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；SYC智能恒溫超級(jí)水槽（鞏義市英谷予華儀器廠）；pHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；電子天平（上海天平儀器廠）。

殼聚糖（南通雙林生物制品有限公司，Mr：95000，脫乙酰度：91.3%）；甘油（浙江遂昌甘油廠）；硼砂（自貢鴻鶴制藥有限責(zé)任公司）；美洛昔康（南京長澳制藥有限公司，批號(hào)：071208，含量：99%）；美洛昔康溫敏凝膠（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，批號(hào)：080604、080610、080620，美洛昔康含量：0.035%）；其余試劑均為分析純。

2 制備

2.1 空白凝膠的制備

殼聚糖用1%的醋酸溶解，制備成2%的溶液。加入一定量的甘油后，在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚴顾萌芤旱膒H值為7.0。將該混合溶液放入37℃的恒溫水浴中保持20 min，使體系膠凝充分，得到殼聚糖-甘油-硼砂水凝膠，該空白凝膠在室溫下為可流動(dòng)的液態(tài)，放置于37℃恒溫水浴并保持20 min，得到均一的半固體狀態(tài)，倒置裝凝膠的西林瓶，凝膠不流動(dòng)。室溫及37℃條件下空白凝膠的形態(tài)詳見圖1。

圖1 空白凝膠在不同條件下的形態(tài)A.室溫；B.37 ℃Fig 1 Morphology of blank hydrogel at different conditionsA.at room temperature；B.at 37℃

2.2 美洛昔康溫敏凝膠的制備

殼聚糖以1%的醋酸溶解，制備成2%的溶液。加入一定量甘油和美洛昔康藥物溶液，室溫?cái)嚢钘l件下逐滴加入硼砂溶液，使所得溶液的pH值為7.0，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆颍湃?7℃恒溫水浴中使其膠凝完全。

3 影響因素考察

3.1 溫度

按“2.1”項(xiàng)下方法制備殼聚糖-甘油-硼砂水凝膠，取未凝前樣品5份，每份2 mL，分別加入5個(gè)長10 cm、直徑1.4 cm的玻璃試管中，將試管分別放至于30℃、32℃、35℃、37℃、40℃的恒溫水浴中，每半分鐘取出觀察凝膠形成情況，以試管倒置30 s內(nèi)凝膠不流動(dòng)為凝膠形成的標(biāo)志[4]，重復(fù)試驗(yàn)3次，記錄凝膠形成平均所需的時(shí)間。溫度對(duì)凝膠形成的影響詳見表1。

表1 溫度對(duì)凝膠形成的影響Tab 1 Effect of temperature on formation of gel

表1結(jié)果表明，當(dāng)環(huán)境溫度低于32℃時(shí)，凝膠不能形成，呈溶液狀；當(dāng)環(huán)境溫度高于32℃時(shí)，凝膠形成，呈半固體狀，并且溫度越高，膠凝時(shí)間越短；當(dāng)環(huán)境溫度為37℃時(shí)，凝膠從液態(tài)變成半固態(tài)只需3 min，表明本凝膠注射進(jìn)入體內(nèi)后能迅速膠凝，避免隨體液流失。

3.2 pH值

取殼聚糖2%溶液，加入甘油制備7份。每一份在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，分別調(diào)節(jié)凝膠體系pH值至6.2、6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.2，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?。觀察凝膠形成情況以及膠凝時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，記錄凝膠形成平均所需的時(shí)間。pH值對(duì)凝膠形成的影響詳見表2。

表2 pH值對(duì)凝膠形成的影響Tab 2 Effect of pH on formation of gel

表2結(jié)果表明，本凝膠在近中性的環(huán)境中形成（pH值范圍為6.7～7.1）。pH值低于6.7的體系，凝膠不能形成，呈溶液狀。pH值高于7.1的體系，隨著硼砂的繼續(xù)加入，凝膠體系即刻成沉淀。在pH 6.7～7.1范圍內(nèi)，隨著體系pH的升高，膠凝所需時(shí)間越短。pH 6.7和pH 6.9的凝膠體系膠凝所需時(shí)間較長。pH 7.1的凝膠體系濁度較高，偶見絲狀沉淀物，故本研究采用pH 7.0的凝膠體系。

3.3 甘油與殼聚糖比例

取殼聚糖2%溶液5份，每份分別加入不同量的甘油，使甘油與殼聚糖的比例分別為1∶10、1∶5、3∶10、2∶5、1∶2。并在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，分別調(diào)節(jié)凝膠體系pH至7.0，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?。觀察凝膠形成情況以及膠凝時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，記錄凝膠形成平均所需時(shí)間。甘油比例對(duì)凝膠形成的影響詳見表3。

表3 甘油與殼聚糖比例對(duì)凝膠形成的影響Tab 3 Effect of the ratio of glycerin to chitosan on formation of gel

表3結(jié)果表明，隨著甘油比例的增加，調(diào)節(jié)凝膠體系至固定pH值所需要硼砂溶液的量就越多，凝膠體系中含水量越多，形成凝膠所需要的時(shí)間越長。甘油-殼聚糖比例在1∶10和1∶5時(shí)，凝膠形成的時(shí)間很短，但是未凝前體系太黏稠，不適于注射給藥。甘油-殼聚糖比例在3∶10時(shí)，膠凝需時(shí)3 min，并且未凝前樣品稠度適中，比較適合注射給藥。甘油-殼聚糖比例在2∶5和1∶2時(shí)，凝膠形成所需的時(shí)間較長。

4 殼聚糖-甘油-硼砂溫敏凝膠中美洛昔康體外釋放度的考察

4.1 紫外分析方法的建立

4.1.1 測(cè)定波長的選擇。稱取10 mg的美洛昔康溶于100 mL的0.1 mol·L－1的NaOH中，經(jīng)稀釋制得10 mg·L－1的美洛昔康對(duì)照溶液，以0.1 mol·L－1的NaOH為空白對(duì)照，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果美洛昔康在364 nm波長處有最大吸收單峰，故確定364 nm為美洛昔康紫外檢測(cè)波長。

4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。制備20.05 mg·L－1的美洛昔康母液，分別取1.0、2.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL的容量瓶中，定容，于364 nm波長處測(cè)定吸光度，以美洛昔康的吸光度（A）對(duì)濃度（C）作線性回歸，得回歸方程C＝17.052A+0.2387（r＝0.9994）。結(jié)果表明，美洛昔康檢測(cè)濃度線性范圍為2.005～12.030 mg·L－1。

4.1.3 精密度試驗(yàn)。精密吸取美洛昔康同一濃度對(duì)照溶液（10 mg·L－1）于364 nm波長處測(cè)定吸光度，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，峰面積均值RSD＝0.25%，表明儀器精密度良好。

4.1.4 回收率試驗(yàn)。精密吸取美洛昔康高、中、低3個(gè)濃度各2份的對(duì)照溶液，加入到按“2.1”項(xiàng)下方法制備的空白凝膠中，再加入0.1 mol·L－1的NaOH，攪拌使溶解，過濾，取續(xù)濾液用0.1 mol·L－1的NaOH定容，測(cè)定吸光度。結(jié)果，平均回收率為98.03%，RSD＝0.65%（n＝6）。

4.1.5 樣品含量測(cè)定。精密稱取3批美洛昔康溫敏凝膠樣品各2 g，按“4.1.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定美洛昔康的含量。結(jié)果，3批樣品中美洛昔康的標(biāo)示含量分別為97.35%、96.89%、97.90%（n＝3），平均標(biāo)示含量為97.38%。

4.2 體外釋放度的測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備美洛昔康溫敏凝膠未凝前的樣品10 g（批號(hào)：080604、080610、080620），分別放入3個(gè)50 mL的圓底離心管中，于37℃恒溫水浴中放置20 min使該體系膠凝充分，膠凝后在凝膠上部加15 mL、pH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）作為釋放介質(zhì)（達(dá)到漏槽條件）。將裝凝膠的離心管放入37 ℃、100 r·min－1的恒溫?fù)u床中，分別于1、3、5、7、10、24、48、96、144、192、240、288 h取5 mL釋放樣品，同時(shí)補(bǔ)加5 mL同溫空白釋放介質(zhì)。用紫外分光光度法分析釋放樣品，計(jì)算其累積體外釋放百分率。3批樣品的體外釋放曲線詳見圖2。

圖2 3批樣品體外釋放曲線Fig 2 Release curves of 3 batches of samples in vitro

圖2結(jié)果表明，3批樣品48 h時(shí)平均累積釋放百分率達(dá)56%，288 h時(shí)達(dá)76%。在288 h時(shí)取出凝膠樣品，凝膠依然呈半固體狀。

對(duì)3批樣品的體外釋放行為進(jìn)行相似因子（f2）法[5]比較，f2的計(jì)算公式如下：

當(dāng)f2值在50～100之間時(shí)，認(rèn)為2種制劑的體外釋藥行為無顯著性差異。在該公式中，Rt和Tt表示2個(gè)批號(hào)的制劑在t時(shí)間點(diǎn)的平均累積釋放百分率，n為測(cè)試點(diǎn)數(shù)。批號(hào)080604和080610的f2值為58.4，批號(hào)080604和080620的f2值為51.4，批號(hào)080610和080620的f2值為69.4，表明3個(gè)批號(hào)的樣品體外釋藥行為無顯著性差異。

5 討論

在288 h時(shí)取出凝膠樣品觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠依然呈半固體狀，與0 h相比，凝膠骨架結(jié)構(gòu)更緊致了，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，這可能是后半段時(shí)間美洛昔康從凝膠中釋放速度減慢的一個(gè)重要原因。

殼聚糖-甘油-硼砂溫敏凝膠制備條件溫和，符合環(huán)保要求。作為一種藥物載體骨架系統(tǒng)，能夠在一定程度上控制藥物的被動(dòng)擴(kuò)散，即可作為注射植入性材料，也可用于腔道非注射性涂抹，是一種可注射的緩控釋藥物給藥系統(tǒng)。本凝膠溫度敏感性高，機(jī)械強(qiáng)度好，有望用于藥物載體、生物組織工程等領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究制備的美洛昔康溫敏凝膠是可供關(guān)節(jié)腔注射的、具備緩釋性能的新型藥物制劑，為美洛昔康治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疼痛性骨關(guān)節(jié)炎提供了一種新的給藥方式。

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