三草方不同極性部位及其配伍后對人肺腺癌SPC-A-1細胞的影響研究Δ

邵振中，賈曉斌，陳彥，封亮，施峰（.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點實驗室/國家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點研究室，南京市 20028；2.江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江市 2203）

中藥復方三草方（SCF）是江蘇省中醫(yī)藥研究院治療非小細胞性肺癌的臨床驗方，由夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草等藥味組成，具有滋補肝腎、清熱利濕、散結(jié)抗癌之功效。在臨床應用中該驗方被證明不僅可以改善癥狀，提高患者的生存質(zhì)量，而且可以減少復發(fā)，延長患者的生存期。本研究制備了SCF的水煎液及不同極性部位提取物，以SPC-A-1肺腺癌細胞株為模型，篩選出最有效抗癌極性部位，并明確提出了不同極性間的最佳配伍方案，為制備療效更好的該復方制劑作準備，并為進一步闡明其抗肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；BS203型倒置顯微鏡（日本Coic公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；真空恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草等藥材購于安徽亳州滕王藥業(yè)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院吳德康教授鑒定均為真品；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；順鉑（DDP，南京制藥廠有限公司，批號：20071104）；四甲基偶氮唑藍（MTT，南京生興生物有限公司）。

1.3 細胞

SPC-A-1細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫。

2 方法

2.1 SCF的提取與制備

2.1.1 水煎液的提?。喊刺幏奖壤Q取該復方，用10倍量的沸水提取2次，每次2 h，提取液經(jīng)40目篩過濾后混合，定容至含生藥量100 mg·mL-1。實驗前用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，給藥時用PBS溶液稀釋至所需濃度。

2.1.2 各極性部位的提?。喊刺幏奖壤Q取該復方，依次用10倍量的95%、60%、30%乙醇溶液和水回流提取2次，每次1 h，濾過，回收乙醇，濃縮液真空干燥（溫度60℃），95%和60%醇提部位用一定量含5%乙醇的PBS溶液溶解（有機相終濃度不超過0.5%），30%醇提部位和水提部位用一定量的PBS溶液溶解。這4個極性部位提取物均制成生藥含量為100 mg·mL-1的SCF各極性提取液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，實驗時用PBS溶液稀釋至所需的藥物濃度。

2.2 SCF水煎液及各極性部位對SPC-A-1細胞增殖活性的影響

取對數(shù)生長期細胞使其脫壁，用10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液，以每孔2.5×104個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100 μL。將培養(yǎng)板移入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液90 μL，再加入10 μL SCF水煎液及各極性提取部位不同濃度的PBS溶液，經(jīng)初步的預實驗，生藥濃度均設置為10.0、5.0、2.0、0.4、0.08 mg·mL-1梯度。然后移入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，每個藥物濃度設6個平行復孔，設上下本底對照孔，另設陽性對照組（DDP，濃度為25 mg·L-1）和PBS空白對照組。36 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT 溶液10 μL，5%CO2、37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加DMSO 100 μL，在微量振蕩儀振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標儀測定吸光度（A）值，檢測波長為550 nm，參比波長為690 nm。藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）用SPSS 10.0軟件進行計算。實驗重復3次。按下式計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率（%）＝（1－用藥組平均A值/空白對照組平均A值）×100%

2.3 SCF各極性部位配伍后對SPC-A-1細胞增殖活性的影響

采用60%醇提部位與其它1個或多極性部位按1∶1等生藥量進行配伍。60%醇提部位與95%醇提部位的配伍和60%醇提部位、95%醇提部位再與其它1個或2個極性部位配伍，其生藥濃度均設置為1.0、0.4、0.2、0.08、0.016 mg·mL-1梯度；60%醇提取部位與30%醇提部位的配伍、60%醇提部位與30%醇提及水提2個部位的配伍、60%醇提部位與水提部位的配伍，其生藥濃度均設置為2.0、1.0、0.4、0.2、0.08 mg·mL-1梯度。實驗操作同“2.2”項下方法。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

經(jīng)各組藥物處理的SPC-A-1細胞直接置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 SCF水煎液及各極性部位對SPC-A-1細胞的增殖抑制作用

SCF60%醇提部位、95%醇提部位及水煎液對SPC-A-1細胞均有顯著的抑制作用，SCF水煎液和各極性部位對SPC-A-1細胞的抑制作用都有劑量依賴性；SCF60%醇提部位對SPC-A-1細胞的IC50最低，與其它各組藥物均有顯著性差異（P＜0.05），說明60%醇提部位對SPC-A-1細胞的抑制作用最好，其次為SCF水煎液。故采用60%醇提部位與其它1個或多極性部位按1∶1等生藥量進行配伍。復方水煎液和各極性部位對SPC-A-1細胞增殖作用的影響見圖1；各組藥物對SPC-A-1細胞的IC50見圖2。

圖1 復方水煎液和各極性部位對SPC-A-1細胞增殖作用的影響Fig 1 Effect of various polarity fractions of SCF and compound decoction with different concentration on proliferation of SPC-A-1 cells

圖2 各組藥物對SPC-A-1細胞的IC50與60%醇提部位比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 2 IC50of various drugs for SPC-A-1 cellsvs.60%ethanol extract：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 SCF各極性部位合并后對SPC-A-1細胞的增殖抑制作用

SCF 60%醇提部位與其它1個或多個醇提部位按1∶1等生藥量配伍后，對SPC-A-1細胞均有顯著的抑制作用，并且呈劑量依賴關(guān)系；在60%醇提部位與其它1個或多個極性部位的配伍中，它們的IC50與60%醇提部位的IC50比較呈顯著性降低（P＜0.01）。這說明95%、30%醇提和水提部位對60%醇提部位均有一定的協(xié)同抑瘤作用。60%醇提部位與95%醇提部位配伍后，或60%與95%醇提部位再加上1個或者2個其它部位配伍后，IC50均無顯著性變化（P＞0.05）；60%醇提部位與30%醇提部位和水提部位之間的配伍，它們的IC50也無顯著性變化（P＞0.05）；而后三者與60%醇提部位與95%醇提部位的配伍比較，有顯著性差異。這說明用60%與95%醇提部位配伍后就可以達到預期的要求。各極性部位配伍后對SPC-A-1細胞的IC50見圖3。

3.3 細胞形態(tài)學觀察

為后續(xù)研究SCF各提取部位對腫瘤細胞作用的機制，采用倒置顯微鏡觀察SPC-A-1細胞生長情況。結(jié)果表明，經(jīng)SCF各提取物處理36 h后的SPC-A-1細胞生長受到抑制，并出現(xiàn)貼壁生長細胞典型的凋亡形態(tài)變化現(xiàn)象，細胞浮懸于培養(yǎng)液中，細胞體積縮小、變圓，核顏色加深，細胞透明度和黏附力降低；而PBS對照組SPC-A-1細胞生長良好，貼壁生長，體積大，細胞核以圓形或橢圓形為主。這說明SCF各提取物有可能是通過促進細胞凋亡來抑制SPC-A-1細胞生長增殖的。各組藥物作用SPC-A-1細胞36 h后倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學變化見圖4。

圖3 各極性部位配伍后對SPC-A-1細胞的IC50與60%醇提部位比較：＊P＜0.01；與60%和95%醇提部位配伍比較：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 3 IC50of various polarity fractions of SCF after mixing for SPC-A-1 cellsvs.60%ethanol extract：＊P＜0.01；vs.60%ethanol extract combined with 95%ethanol extract：#P＜0.05，##P＜0.01

圖4 各組藥物作用SPC-A-1細胞36 h后倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學變化A.PBS對照組；B.60%醇提部位（5 mg·mL-1）；C.復方水煎液（10 mg·mL-1）Fig 4 Morphological changes of SPC-A-1 cells treated with various drugs for 36 h under inverted microscopeA.PBS control group；B.60%ethanol extract（5 mg·mL-1）；C.compound decoction（10 mg·mL-1）

4 討論

體外抑制腫瘤細胞增殖活性的研究說明，SCF60%和95%醇提部位的合并是最為合適的，這為制備療效更好的該復方制劑提供了一些基礎(chǔ)。SCF60%醇提部位與其它極性部位合并后，IC50均有顯著降低，說明該復方有效組分之間在藥理作用上具有協(xié)同作用，這從一個方面驗證了中藥復方的藥理作用是多種有效組分共同作用的假說[1，2]，也符合筆者所提出的關(guān)于物質(zhì)基礎(chǔ)“三個層次多維結(jié)構(gòu)”假說中的一維結(jié)構(gòu)：由多組分構(gòu)成的整體（即中藥復方的物質(zhì)基礎(chǔ)）其各組分間存在配伍配比關(guān)系[3]。

據(jù)文獻報道，夏枯草、白花蛇舌草中的三萜類化合物——熊果酸與齊墩果酸[3，4]的含量較高，且藥理實驗也證明這2種三萜類物質(zhì)均具有較好的直接抑制腫瘤細胞的作用[5～7]。經(jīng)初步化學試驗表明，SCF水煎液中含有三萜類、黃酮類、酚類和糖類物質(zhì)；SCF60%與95%醇提部位主要含有三萜類、黃酮類和酚類化合物；而SCF30%醇提與水提部位主要含有黃酮類和糖類化合物。且本研究結(jié)果也證實，SCF水煎液、60%和95%醇提部位對人肺腺癌SPC-A-1細胞的IC50顯著低于SCF30%醇提和水提部位，由此推斷SCF中的三萜類有機酸類化合物可能是直接抑制腫瘤細胞增殖活性的主要有效成分。

本研究采用體外腫瘤細胞模型進行篩選，研究了SCF中各極性部位及其合并后對腫瘤細胞的直接殺傷作用，筆者準備進一步研究促進機體免疫反應的間接抑瘤作用和功能組分對有效組分的作用，為劑型優(yōu)化作進一步準備，并闡明SCF抗肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)制抗肺癌現(xiàn)代復方中藥提供科學依據(jù)。

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