丁苯肽對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的實(shí)驗(yàn)研究

王欣東 陳淅泠 李秋霞 張曉峰

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 鄭州 450014

血管性癡呆是由不同腦血管病變所致，以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)的慢性獲得性嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，為腦血管疾病常見后遺癥之一，給患者家庭帶來很大困擾。丁苯肽是我國開發(fā)的抗腦缺血新藥，可從多個(gè)環(huán)節(jié)起到抗腦缺血作用。丁苯肽對(duì)血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙是否有治療作用，目前報(bào)道不多。我們擬采用血管性癡呆大鼠動(dòng)物模型，探討丁苯肽在血管性癡呆中的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與器材 健康雄性Wister大鼠42只，體質(zhì)量（400±20）g（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買），丁苯肽（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供），MG－2－Y型迷宮（張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠），P38 MAPK特異性抗體（北京博奧森公司，兔源，對(duì)大鼠P38MAPK特異），iNOS特異性抗體（美國Santa Cruz公司，兔源，對(duì)鼠iNOS特異），SP9000試劑盒（北京中杉生物工程公司），TUNEL試劑盒及DAB顯色劑（北京博奧森公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、模型制作及給藥方法：大鼠在試驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)把42只大鼠分到假手術(shù)組，模型組，丁苯肽組。3組大鼠均用10％水合氯醛（3.5 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，成功后沿頸部正中縱向切開皮膚，鈍性分離開皮下筋膜及肌肉組織至雙側(cè)頸總動(dòng)脈，模型組與丁苯肽組每側(cè)頸總動(dòng)脈用0號(hào)手術(shù)絲線雙結(jié)扎，從中間剪斷，縫合手術(shù)切口。術(shù)后保暖，待蘇醒，放回清潔籠箱繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎外，亦按上述手術(shù)過程操作。術(shù)后2周，丁苯肽治療組按65mg/（kg·只），植物油稀釋成2mL給于丁苯肽灌胃，模型組與假手術(shù)組僅分別給于2mL植物油，3組均1次/d，連續(xù)2月。

1.2.2 Y－型迷宮試驗(yàn)：在光線暗的房間中且周圍安靜境況下進(jìn)行試驗(yàn)，先將大鼠放入起步區(qū)（大鼠開始所在臂）適應(yīng)5 min，當(dāng)安全區(qū)信號(hào)燈亮起5 s后給起步區(qū)與非安全區(qū)加電，而安全區(qū)不給加電，當(dāng)大鼠被電擊后跑至安全區(qū)為一次訓(xùn)練完成。電擊后大鼠直接跑至安全區(qū)為正確反應(yīng)。上一次結(jié)束后原來的安全區(qū)5 s后變?yōu)橄乱淮斡?xùn)練的起步區(qū)，重復(fù)上一次過程。安全區(qū)與電擊區(qū)的位置按順時(shí)針變換，測(cè)10次休息5 min，用10次中連續(xù)出現(xiàn)9次正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)代表大鼠學(xué)習(xí)能力強(qiáng)弱。24 h候后，每個(gè)大鼠測(cè)10次，以正確反應(yīng)次數(shù)代表記憶能力強(qiáng)弱。

1.2.3 免疫組化及Tunel染色：迷宮試驗(yàn)后，將大鼠麻醉，成功后迅速打開胸腔，在右心房剪開一小口，迅速用5 mL針頭刺入左心室，快速注入生理鹽水，待右心房流出的液體不再含血液后迅速斷頭取腦，把海馬與其他腦組織分離后放入4％甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀方向切片（厚約5μm），每只大鼠隨機(jī)取3張切片分別進(jìn)行p38 mapk、iNOS免疫組化檢測(cè)及Tunel染色（嚴(yán)格按說明書進(jìn)行）。

1.2.4 圖像采集、分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每張切片選取面積大致相同的3個(gè)視野，用德國Lecia顯微照像系統(tǒng)和Biosens Digital Imaging System v1.6系統(tǒng)，測(cè)定灰度值及計(jì)算細(xì)胞凋亡百分比，取三視野平均值做為該切片最后結(jié)果，做為該大鼠觀測(cè)值。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，組間用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力（次數(shù)）比較 見表1。

表1 3組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力±s）

表1 3組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，○P＜0.05

組別 n 學(xué)習(xí) 記憶假手術(shù)組14 34.07±3.09 8.07±1.07模型組 14 74.21±3.01△ 4.64±1.49△丁苯肽組 14 60.78±4.26○ 6.42±1.45○

2.2 3組大鼠海馬區(qū)p38 MAPK、iNOS陽性區(qū)平均灰度值及細(xì)胞凋亡百分比比較 見表2。

表2 3組大鼠海馬區(qū)p38 MAPK、iNOS陽性區(qū)平均灰度值及細(xì)胞凋亡百分比±s）

表2 3組大鼠海馬區(qū)p38 MAPK、iNOS陽性區(qū)平均灰度值及細(xì)胞凋亡百分比±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，○P＜0.05

組別n p38MAPK iNOS 凋亡百分比假手術(shù)組14 10.20±2.32 7.07±2.33 5.07±2.40模型組 14 70.72±4.81△72.51±4.80△61.92±4.19△丁苯肽組14 65.02±4.14○67.11±4.15○35.00±3.32○

3 討論

學(xué)習(xí)記憶障礙是血管性癡呆常見癥狀。學(xué)習(xí)記憶在腦內(nèi)有一定功能區(qū)域位，該位置損害常引起學(xué)習(xí)記憶障礙。海馬是與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系的主要功能區(qū)，在缺血情況下極易損傷，為缺血易損區(qū)之一［1］，損傷后常引起學(xué)習(xí)記憶障，近來研究認(rèn)為海馬缺血性損傷為血管性癡呆的病理基礎(chǔ)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆動(dòng)物海馬區(qū)存在iNOS和p38MAPK高表達(dá)［3－4］。而iNOS是NO合成酶之一，在正常情況下不表達(dá)或極少量表達(dá)，在缺血缺氧等應(yīng)激時(shí)持續(xù)表達(dá)，合成過量NO；過量NO可引發(fā)細(xì)胞凋亡［5］，引起認(rèn)知障礙［6］。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子，p38MAPK不僅與炎癥等密切相關(guān)，還參與細(xì)胞的凋亡過程，缺血缺氧狀態(tài)下其表達(dá)增多且被激活后可調(diào)節(jié)Bc1－2［7］以及bax流入線粒體［8］，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成學(xué)習(xí)記憶減退［9］。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們借助免疫組化法對(duì)3組大鼠海馬區(qū)p38MAPK及iNOS的表達(dá)情況做一檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的確存在著明顯表達(dá)，這與以往研究結(jié)果基本一致。在丁苯酞組中，二者也存在著表達(dá)，但明顯低于模型組（P＜0.05），與假手術(shù)組相比，其表達(dá)仍然是高的（P＜0.05）。3組大鼠海馬細(xì)胞凋亡百分比以模型組最高，丁苯肽組次之，假手術(shù)組最低（P＜0.05）。3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較，發(fā)現(xiàn)丁苯肽組雖不及假手術(shù)組，但較模型組明顯增強(qiáng)，3組兩兩比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，我們認(rèn)為丁苯肽可以用來對(duì)血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙的治療，具體可能是通過降低了iNOS及p38MAPK的表達(dá)，減少了海馬參與學(xué)習(xí)記憶細(xì)胞的凋亡，從而改善血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知障礙，但其具體如何引起iNOS與p38MAPK表達(dá)降低有待研究。

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