• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    辛伐他汀抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的可能表遺傳新機(jī)制

    2010-05-07 02:27:20謝靜李曉瓊王樹人李麗娟
    四川生理科學(xué)雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:汀類調(diào)脂辛伐他汀

    謝靜 李曉瓊 王樹人 李麗娟

    (1.四川省第四人民醫(yī)院病理科,四川 成都 610016;2.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心病理生理學(xué)教研室,四川 成都 610041;3.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,貴州 遵義 563003)

    3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的調(diào)血脂藥物。近年來的大量研究提示,他汀類除調(diào)脂作用外,還具有一系列調(diào)脂外作用,可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。有研究顯示,脂質(zhì)和脂蛋白成份具有直接調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的功能[1],如 VLDL可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖,膽固醇、氧化、糖基化脂蛋白促進(jìn)動脈壁的纖維化等[2]。但在基因水平,脂質(zhì)成份的這些影響多不至于引起基因突變,而更可能是通過表遺傳機(jī)制引起基因的表達(dá)異常。因此,調(diào)脂藥物也可能在表遺傳水平通過對基因表達(dá)調(diào)控的影響進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的功效。

    多梳基因(Polycomb group genes,PcG)的表達(dá)和功能改變目前被認(rèn)為是一個非常早期的環(huán)節(jié)。PcG是一個在機(jī)體發(fā)育過程中控制許多重要基因活性的基因家族,Polycomb復(fù)合物對于胚胎發(fā)育和不同譜系基因抑制及長期基因沉默是必不可少的的主要組份,并與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。As病損中VSM C的增殖與良性腫瘤增殖具有高度相似的單克隆性,因此,誘發(fā)VSMC增殖的早期基因調(diào)控中,很可能會有PcG家族成員的改變。Bmi-1基因?qū)儆赑cG家族的PCR1,與多種干細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換和異常增殖是動脈粥樣硬化的病理生理基礎(chǔ),而多梳基因Bmi-1表達(dá)的變化在VSMC的表型轉(zhuǎn)換和增殖中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,且是其中的早期基因事件[3]。血管平滑肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)至第四代時已經(jīng)發(fā)生了明顯的表型轉(zhuǎn)換[4],因此本研究通過檢測辛伐他汀對體外培養(yǎng)的第四代血管平滑肌細(xì)胞多梳基因Bmi-1的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響,以觀察調(diào)脂藥物是否可以在表遺傳水平發(fā)揮作用,為辛伐他汀的作用機(jī)制提供新的解釋。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器和試劑

    CO2孵箱(Heraeus,Germany);紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer LamBda Bio40,Germany);PCR儀(Biometra,Germany);倒置相差顯微鏡(Nikon,Japan);pH測定儀(4330,JENWAY Ltd,UK);電泳儀和酶標(biāo)儀(BIO-RAD,America);流式細(xì)胞儀(ELITE EST coulter,America);凝膠成像系統(tǒng)(DBT-08,EEC公司)。辛伐他汀、DM EM/F12培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶及RT-PCR試劑盒(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司);四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MT T)和PI染料(Sigma公司);AnnexinⅤ/PI試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

    取8w齡雄性SD大鼠,體重120g左右,購自四川中藥研究所,常規(guī)處死,剖胸取出胸主動脈。分離血管周圍組織,縱向剖開血管,分離中、外膜。將中膜剪成 1 mm×1 mm×1 mm組織塊。添加含有20%小牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7-9d后細(xì)胞達(dá)匯合狀態(tài)時,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代。取第1~4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

    實(shí)驗(yàn)分兩組:對照組和辛伐他汀處理組。對照組:正常生長的第四代平滑肌細(xì)胞;辛伐他汀處理組:不同濃度辛伐他汀(5,10,20,40μ mol?L-1)作用第四代平滑肌細(xì)胞 12、24和36h。

    1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Bmi-1 mRNA

    用Trizol試劑提取各組大鼠VSMC總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。Bmi-1引物序列上游為5'-AGA GAA GCC AAA GGA GGAGGT-3',下游為 5'-GAT GAT TTC CGA GGT CTACTG G-3',擴(kuò)增長度為494bp;內(nèi)參L-19引物序列上游為5'-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG-3',下游為 5'-GGA CAG AGT CT T GAT GAT CTC-3',擴(kuò)增長度為194bp。兩對引物均加入25μ L反應(yīng)體系中,PCR反應(yīng)條件為 94℃變性45s,56℃復(fù)性45s,72℃延伸60s,共35個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)20g?L-1瓊脂糖膠分離后凝膠成像系統(tǒng)攝影,用Gel-pro凝膠定量分析軟件分析RT-PCR產(chǎn)量。

    1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

    取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔2×105的量接種于6孔板,4h后加入終濃度 0、5、10、20、和 40μ mol? L-1的辛伐他汀,藥物處理后12、24和36h在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)。

    1.2.5 四甲基偶氮唑鹽法測定細(xì)胞增殖活力

    分別收集對數(shù)生長期細(xì)胞,用胰酶消化,制成細(xì)胞懸液(5×1012? L-1),加入 96 孔培養(yǎng)板,每孔 200μ L,置 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液,按分組設(shè)計(jì)加入不同濃度(0、5、10、20、和 40μ mol? L-1)辛伐他汀,分別培養(yǎng) 12、24和36h,在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20μ L MT T(5g?L-1),置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中作用4h,除去上清液,加入 150μ L DMSO溶解,平板振蕩儀振蕩10min,酶標(biāo)儀490nm波長檢測各孔吸光度值。以只加培養(yǎng)液不含細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白對照組。

    1.2.6 細(xì)胞周期及凋亡檢測

    選取 24h 作 為時 間點(diǎn),加 入不同 濃度(0、5、10、20、和40μ mol?L-1)辛伐他汀培養(yǎng)細(xì)胞后,用 0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,800 r?min-1離心5min,棄去培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,離心去PBS,加入冰預(yù)冷的 70%乙醇固定,4℃冰箱中保存。染色前以PBS離心沉淀去除固定液,加入PI染色,4℃避光30min,上機(jī)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。同樣用胰酶消化收集不同濃度組辛伐他汀液培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,按照AnnexinⅤ/PI試劑盒說明進(jìn)行操作,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 辛伐他汀對第四代大鼠血管平滑肌細(xì)胞Bmi-1 mRNA表達(dá)水平的影響

    采用RT-PCR檢測Bmi-1的mRNA表達(dá)水平。不同濃度辛伐他汀作用細(xì)胞12、24、36h后,Bmi-1的 mRNA表達(dá)水平隨作用濃度的增加和時間的延長呈下降趨勢(P<0.05,n=3)。(見圖1)

    2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

    加藥前對照組與辛伐他汀加藥組平滑肌細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)基本一致;加藥12、24和 36h后,對照組細(xì)胞生長良好、數(shù)量隨生長時間增長而增多,細(xì)胞大小均勻、形態(tài)一致并呈梭形,高倍鏡下可見細(xì)胞染色質(zhì)疏松、胞質(zhì)豐富。加藥組細(xì)胞培養(yǎng) 12h后,辛伐他汀低濃度組與對照組相比變化不明顯,40μ mol?L-1組可見細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞大小和形態(tài)不均,部分細(xì)胞胞體腫脹變圓。藥物作用24和36h后,各實(shí)驗(yàn)組均可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞大小不一,形態(tài)不規(guī)則,高倍鏡可見細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)減少以及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡,大部分細(xì)胞脫壁呈半懸浮狀態(tài),以上細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)改變隨藥物作用時間的延長和濃度的增加而更明顯(見圖2)。

    2.3 辛伐他汀對平滑肌細(xì)胞生長的抑制作用

    M TT試驗(yàn)顯示,辛伐他汀作用12、24和36h后,各濃度組均出現(xiàn)了不同程度的生長抑制(P<0.05,n=14;見圖3)。

    圖3 不同時間和濃度辛伐他汀對VS MC s的A490值的影響

    2.4 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測

    經(jīng) 5、10、20、40μ mol?L-1的辛伐他汀作用 24h 后,平滑肌細(xì)胞凋亡率明顯增加。細(xì)胞周期檢測顯示G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期細(xì)胞比例明顯降低,顯示細(xì)胞主要阻滯于G0/G1期,且隨著濃度的增高及時間的延長,細(xì)胞凋亡和周期阻滯越明顯(見表1,圖4)。

    3 討論

    近年來,隨著人們生活水平的提高和工作節(jié)奏的加快,心腦血管病的發(fā)病率和病死率都呈明顯的上升態(tài)勢。動脈粥樣硬化是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ),引起動脈粥樣硬化和冠心病的危險因素很多,其中脂質(zhì)代謝紊亂尤為重要。

    表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細(xì)胞周期的影響(,n=3)

    表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細(xì)胞周期的影響(,n=3)

    ▲P<0.05與對照組比較;★P<0.05與不同濃度組間比較。

    組別 凋亡率(%) G0/G1 S空白對照組 8.30±0.95 56.40±3.20 38.67±3.30辛伐他汀5μ mol?L-1組 10.83±1.36 62.10±1.95▲★ 28.53±5.50▲★辛伐他汀10μ mol?L-1組 15.27±2.85▲★ 67.97±2.72▲★ 21.53±3.69▲辛伐他汀20μ mol?L-1組 19.90±0.26▲★ 73.20±1.22▲ 15.87±2.99▲辛伐他汀40μ mol?L-1組 25.50±1.99▲★ 75.43±1.19▲ 12.50±1.40▲

    圖4 24h不同濃度辛伐他汀處理后細(xì)胞周期的變化

    3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的調(diào)血脂藥物。HMGCoA還原酶是細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸(M VA)合成途徑的限速酶,其催化產(chǎn)物MVA及下游產(chǎn)物參與細(xì)胞膜構(gòu)成、糖蛋白合成、電子傳遞、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期進(jìn)展等重要的生物學(xué)功能[5]。他汀類藥物通過對該酶特異性抑制作用,使HMG-CoA不能轉(zhuǎn)變成MVA,從而阻斷膽固醇的合成,降低血膽固醇的水平,已普遍用于臨床治療高脂血癥。近年來的大量研究提示,他汀類除調(diào)脂作用外,還具有調(diào)脂外作用,主要包括改善內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和聚集、誘導(dǎo)凋亡和抑制炎癥反應(yīng),減緩斑塊的形成,減小斑塊大小及穩(wěn)定斑塊等作用[6]。

    他汀類藥物能通過多種途徑抑制細(xì)胞增殖,如:抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成,使質(zhì)膜的構(gòu)成比例變化,導(dǎo)致細(xì)胞通訊連接子的構(gòu)象或功能改變[7];破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[8];下調(diào)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性[9];增加表達(dá)周期素依賴性蛋白激酶抑制因子,導(dǎo)致細(xì)胞在G0/G1阻滯[10]。他汀類藥物誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要在于通過影響M VA途徑而發(fā)揮作用:當(dāng)MVA代謝產(chǎn)物水平下降時,關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的異戊烯化受阻,引起調(diào)控細(xì)胞凋亡的一系列分子表達(dá)改變,包括原癌基因和抑癌基因的產(chǎn)物,從而影響凋亡信號級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

    雖然調(diào)脂治療作用可解釋臨床上應(yīng)用他汀類獲得的較多益處,但更多研究支持他汀類藥物具有調(diào)脂以外的臨床益處,他汀類的非調(diào)脂作用可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。辛伐他汀除了通過以上途徑引起細(xì)胞的增殖抑制和凋亡外,是否在表遺傳方面發(fā)揮作用尚未見報導(dǎo)。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在使用安全用藥濃度范圍內(nèi)的辛伐他汀作用于發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的平滑肌細(xì)胞后,能明顯降低Bmi-1基因的表達(dá),同時抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。這表明辛伐他汀確能通過影響表遺傳調(diào)控過程發(fā)揮抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用,從而揭示了辛伐他汀抗動脈粥樣硬化的另一新的作用機(jī)制。

    1 Zaina S,Dossing KB,Lindholm MW,et al.Chromatin modification by lipids and lipoprotein components:an initiating event in atherogenesis?[J].Curr Opin Lipidol,2005,16(5):549-553.

    2 Lipskaia L,Pourci M-L,Delomenie C,et al.Phosphoinositol 3-kinase and calcium-activated transcription pathway s are required for V LDL-induced smooth muscle cell proliferation[J].Circ Res,2003,92(10):1115-1122.

    3 謝靜,李麗娟,王樹人,等.體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞多梳基因Bmi-1的表達(dá)變化及其與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的關(guān)系[J].中國動脈硬化雜志,2009,17(1):43-47.

    4 王生蘭,蘇娟,徐一洲,等.大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的表型轉(zhuǎn)換及表型鑒定[J].中國動脈硬化雜志,2008,16(4):268-272.

    5 Goldstein JL,Brown MS.Regulation of the mevalonate pathway[J].Nature,1990,343(6257):425-430.

    6 Athyros VG,Kakafika AI,Tziomalos K,et al.Pleiotropic effects of statins-clinical evidence[J].Current Pharmaceutical Design,2009,15(5):479-489.

    7 周永,糜漫天,朱俊東,等.洛伐他汀對MCF-7細(xì)胞增殖分化功能及間隙連接細(xì)胞通訊的影響[J].癌癥,2003,22(3):257-261.

    8 Florio T,T hellung S,Arena S,et al.Somatostatin and its analog lanreotide inhibit the proliferation of dispersed human non-functioning pituitary adenoma cells in vitro[J].Eur J Endocrinol,1999,141(4):396-408.

    9 Holstein SA,Hohl RJ.Interaction of cy tosine arabinoside and lovastatin in human leukemia cells[J].Leukemia Res,2001,25(8):651-660.

    10 Zuckerbraun BS,Shapiro RA,Billiar TR,et al.RhoA influences the nuclear localization of extracellular signal-regulated kinases to modulate p21Waf/Ciplexpression[J].Circulation,2003,108(7):876-881.

    11 Xia Z,T an MM,Wong WW,et al.Blocking protein gerany lgeranylation is essential for lovastatin-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells[J].Leukemia,2001,15(9):1398-1407.

    猜你喜歡
    汀類調(diào)脂辛伐他汀
    高脂血癥的用藥選擇
    對付心血管病要用好他汀類藥
    他汀類聯(lián)合心血管藥物治療心血管疾病的效果分析
    他汀類聯(lián)合心血管藥物治療心血管疾病臨床探討
    他汀類降脂藥致肝損害的診斷研究進(jìn)展
    辛伐他汀對高血壓并發(fā)陣發(fā)性心房顫動的作用及機(jī)制
    辛伐他汀聯(lián)合曲美他嗪對糖尿病伴冠心病的影響
    腦梗死應(yīng)用辛伐他汀聯(lián)合抗栓治療的臨床觀察
    依折麥布聯(lián)合辛伐他汀用于冠心病調(diào)脂治療未達(dá)標(biāo)患者49例
    更 正
    午夜视频精品福利| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99热网站在线观看| 满18在线观看网站| 亚洲精品美女久久av网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产精品国产av在线观看| 18禁观看日本| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 99热网站在线观看| 黄片大片在线免费观看| 大香蕉久久网| 男女床上黄色一级片免费看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品人妻1区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 91大片在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 18在线观看网站| 国产精品av久久久久免费| 国产成人精品久久二区二区91| 99精国产麻豆久久婷婷| 美女高潮到喷水免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91成人精品电影| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美成人午夜精品| 女性被躁到高潮视频| 精品福利观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲成国产人片在线观看| 99香蕉大伊视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久亚洲真实| 日韩欧美免费精品| 国产欧美亚洲国产| avwww免费| 老熟女久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品高清国产在线一区| 高清欧美精品videossex| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 免费日韩欧美在线观看| 高清欧美精品videossex| 国产1区2区3区精品| 午夜福利视频精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | av福利片在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品成人在线| 桃红色精品国产亚洲av| 十八禁人妻一区二区| 久久久久国内视频| 久久久久久久精品吃奶| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91成年电影在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 在线看a的网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产精品国产av在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品人妻在线不人妻| 黄片小视频在线播放| 日韩三级视频一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 美女视频免费永久观看网站| 精品国产亚洲在线| 无限看片的www在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 午夜福利视频精品| 国产精品电影一区二区三区 | 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品免费大片| av网站在线播放免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 中文字幕色久视频| 国产97色在线日韩免费| 久久久久视频综合| 精品久久久久久电影网| 国产成人欧美在线观看 | 免费在线观看黄色视频的| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产午夜精品久久久久久| h视频一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 极品教师在线免费播放| 51午夜福利影视在线观看| 天天添夜夜摸| 亚洲人成77777在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 69av精品久久久久久 | 亚洲一区中文字幕在线| av电影中文网址| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品99久久99久久久不卡| av电影中文网址| 精品国产国语对白av| 日日爽夜夜爽网站| 黄色毛片三级朝国网站| 国产成人免费无遮挡视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产不卡一卡二| 岛国毛片在线播放| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲,欧美精品.| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产高清videossex| 91麻豆av在线| 国产精品 欧美亚洲| www.精华液| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品电影一区二区三区 | 99精品在免费线老司机午夜| 丝袜美足系列| 午夜日韩欧美国产| 欧美性长视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产精品久久久av美女十八| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲 国产 在线| 人妻 亚洲 视频| h视频一区二区三区| 久热这里只有精品99| 亚洲视频免费观看视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 深夜精品福利| 成年人免费黄色播放视频| videosex国产| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费在线观看黄色视频的| 一级毛片女人18水好多| 国产成人系列免费观看| 超碰97精品在线观看| 成年动漫av网址| 久久中文字幕人妻熟女| 99国产综合亚洲精品| 黄频高清免费视频| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 久久免费观看电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品.久久久| 免费看十八禁软件| 亚洲国产av新网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91大片在线观看| netflix在线观看网站| 麻豆乱淫一区二区| h视频一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费观看人在逋| 久9热在线精品视频| 成人国产av品久久久| 成人特级黄色片久久久久久久 | 国产色视频综合| 99热网站在线观看| 正在播放国产对白刺激| 一级毛片精品| 757午夜福利合集在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av线在线观看网站| 午夜福利乱码中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 男女免费视频国产| 黄色片一级片一级黄色片| 2018国产大陆天天弄谢| 下体分泌物呈黄色| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久狼人影院| 免费观看人在逋| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜免费鲁丝| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产一卡二卡三卡精品| 电影成人av| 亚洲avbb在线观看| 咕卡用的链子| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一区二区日韩欧美中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久这里只有精品19| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 黑丝袜美女国产一区| 又大又爽又粗| 少妇的丰满在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品人妻在线不人妻| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 日本av手机在线免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久久久久久久久大奶| 在线av久久热| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 999精品在线视频| 久久狼人影院| 99在线人妻在线中文字幕 | 日韩三级视频一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 麻豆国产av国片精品| 国产高清国产精品国产三级| 老司机深夜福利视频在线观看| 婷婷成人精品国产| h视频一区二区三区| videosex国产| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产成人精品久久二区二区免费| 麻豆乱淫一区二区| 少妇精品久久久久久久| 久久精品91无色码中文字幕| 国产激情久久老熟女| 在线观看舔阴道视频| 美女视频免费永久观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲七黄色美女视频| 国产黄色免费在线视频| 午夜老司机福利片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产伦理片在线播放av一区| 久久99一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 日日爽夜夜爽网站| 又紧又爽又黄一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美大码av| 手机成人av网站| 国产真人三级小视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄色片一级片一级黄色片| 一本久久精品| 新久久久久国产一级毛片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产片内射在线| 欧美激情久久久久久爽电影 | 无遮挡黄片免费观看| 五月开心婷婷网| tocl精华| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品熟女久久久久浪| 波多野结衣av一区二区av| 天天添夜夜摸| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品一二三| 国产成人精品在线电影| 最近最新中文字幕大全免费视频| 电影成人av| 成年人黄色毛片网站| 亚洲人成电影观看| 久久精品成人免费网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品国产一区二区久久| aaaaa片日本免费| 午夜激情久久久久久久| 高清在线国产一区| 我的亚洲天堂| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线播放国产精品三级| 正在播放国产对白刺激| 欧美久久黑人一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 人人澡人人妻人| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产伦理片在线播放av一区| 国产色视频综合| 国产精品电影一区二区三区 | 九色亚洲精品在线播放| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品自拍成人| av国产精品久久久久影院| 无遮挡黄片免费观看| 香蕉丝袜av| 成人影院久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 曰老女人黄片| 搡老岳熟女国产| 亚洲av日韩在线播放| 国产人伦9x9x在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜福利欧美成人| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利视频在线观看免费| 十八禁人妻一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产看品久久| 久久国产精品大桥未久av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久国产欧美日韩av| 免费观看av网站的网址| 91麻豆av在线| 岛国在线观看网站| 亚洲第一av免费看| 国产精品 国内视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 满18在线观看网站| 一级片'在线观看视频| av免费在线观看网站| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久青草综合色| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人精品在线电影| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日韩三级视频一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品免费大片| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 宅男免费午夜| 一区二区av电影网| 日韩免费高清中文字幕av| avwww免费| 国产成人影院久久av| 看免费av毛片| videos熟女内射| 亚洲av第一区精品v没综合| 91大片在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久99一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 极品人妻少妇av视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人黄色视频免费在线看| 国产单亲对白刺激| 成人影院久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲国产成人一精品久久久| 大香蕉久久网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一级毛片女人18水好多| 青青草视频在线视频观看| 午夜老司机福利片| 亚洲av成人一区二区三| 999精品在线视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲人成电影免费在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线天堂中文资源库| 欧美大码av| 欧美黑人精品巨大| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 最新的欧美精品一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲av电影在线进入| 黄色怎么调成土黄色| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品一区二区三卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男人操女人黄网站| 一级毛片精品| 国产真人三级小视频在线观看| 国产色视频综合| 黄片播放在线免费| videos熟女内射| tocl精华| 精品福利观看| 91成年电影在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本黄色视频三级网站网址 | 亚洲精品国产区一区二| 国产成人精品在线电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 制服诱惑二区| 香蕉久久夜色| 亚洲第一青青草原| 日韩大片免费观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 中文欧美无线码| 免费在线观看黄色视频的| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 极品人妻少妇av视频| 国产日韩欧美视频二区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久久久久久久久久久大奶| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产不卡一卡二| 操出白浆在线播放| 一级黄色大片毛片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 青青草视频在线视频观看| 在线观看一区二区三区激情| 成人手机av| 国产在视频线精品| 国产伦理片在线播放av一区| 最黄视频免费看| 黄色成人免费大全| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲 国产 在线| 亚洲人成电影观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 一本色道久久久久久精品综合| 飞空精品影院首页| 这个男人来自地球电影免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 超碰成人久久| 免费观看av网站的网址| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久国产精品麻豆| 免费在线观看日本一区| 男女无遮挡免费网站观看| 首页视频小说图片口味搜索| h视频一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产在线观看jvid| 在线观看免费午夜福利视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 女性生殖器流出的白浆| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品成人在线| 下体分泌物呈黄色| 99在线人妻在线中文字幕 | 成人国语在线视频| 超碰97精品在线观看| 久久亚洲真实| www日本在线高清视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久精品91无色码中文字幕| 国产在视频线精品| 岛国毛片在线播放| 国产高清videossex| 国产日韩欧美在线精品| 男人操女人黄网站| 999久久久精品免费观看国产| 大香蕉久久成人网| 老汉色∧v一级毛片| av超薄肉色丝袜交足视频| av电影中文网址| 女性生殖器流出的白浆| 人人澡人人妻人| h视频一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 一本久久精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一个人免费看片子| 夜夜爽天天搞| 亚洲午夜理论影院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产1区2区3区精品| 一二三四社区在线视频社区8| 久久ye,这里只有精品| av线在线观看网站| 亚洲人成电影免费在线| 成人av一区二区三区在线看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级a爱视频在线免费观看| 国产成人精品久久二区二区91| 一区二区三区国产精品乱码| 国产一区二区三区综合在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产又色又爽无遮挡免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 无遮挡黄片免费观看| tocl精华| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久久精品吃奶| 精品福利观看| 国产精品偷伦视频观看了| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 在线看a的网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久久久久免费视频了| 久久久精品免费免费高清| 婷婷丁香在线五月| avwww免费| 高清av免费在线| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | videosex国产| 一级毛片女人18水好多| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人av激情在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 久久av网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久影院123| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男女高潮啪啪啪动态图| 另类亚洲欧美激情| 在线播放国产精品三级| 人妻一区二区av| 久久久久久久久免费视频了| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一级毛片女人18水好多| 女性生殖器流出的白浆| 精品久久久精品久久久| 天堂中文最新版在线下载| 在线观看66精品国产| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩一区二区三区影片| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产日韩欧美视频二区| 欧美乱妇无乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产视频一区二区在线看| 大香蕉久久成人网| 妹子高潮喷水视频| 香蕉国产在线看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久久久精品人妻al黑| 亚洲色图综合在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 欧美久久黑人一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产高清国产精品国产三级| 在线天堂中文资源库| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久国内视频| www.自偷自拍.com| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜91福利影院| 麻豆av在线久日| 91字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| √禁漫天堂资源中文www| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说|