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    辛伐他汀抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的可能表遺傳新機(jī)制

    2010-05-07 02:27:20謝靜李曉瓊王樹人李麗娟
    四川生理科學(xué)雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:汀類調(diào)脂辛伐他汀

    謝靜 李曉瓊 王樹人 李麗娟

    (1.四川省第四人民醫(yī)院病理科,四川 成都 610016;2.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心病理生理學(xué)教研室,四川 成都 610041;3.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,貴州 遵義 563003)

    3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的調(diào)血脂藥物。近年來的大量研究提示,他汀類除調(diào)脂作用外,還具有一系列調(diào)脂外作用,可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。有研究顯示,脂質(zhì)和脂蛋白成份具有直接調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的功能[1],如 VLDL可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖,膽固醇、氧化、糖基化脂蛋白促進(jìn)動脈壁的纖維化等[2]。但在基因水平,脂質(zhì)成份的這些影響多不至于引起基因突變,而更可能是通過表遺傳機(jī)制引起基因的表達(dá)異常。因此,調(diào)脂藥物也可能在表遺傳水平通過對基因表達(dá)調(diào)控的影響進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的功效。

    多梳基因(Polycomb group genes,PcG)的表達(dá)和功能改變目前被認(rèn)為是一個非常早期的環(huán)節(jié)。PcG是一個在機(jī)體發(fā)育過程中控制許多重要基因活性的基因家族,Polycomb復(fù)合物對于胚胎發(fā)育和不同譜系基因抑制及長期基因沉默是必不可少的的主要組份,并與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。As病損中VSM C的增殖與良性腫瘤增殖具有高度相似的單克隆性,因此,誘發(fā)VSMC增殖的早期基因調(diào)控中,很可能會有PcG家族成員的改變。Bmi-1基因?qū)儆赑cG家族的PCR1,與多種干細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換和異常增殖是動脈粥樣硬化的病理生理基礎(chǔ),而多梳基因Bmi-1表達(dá)的變化在VSMC的表型轉(zhuǎn)換和增殖中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,且是其中的早期基因事件[3]。血管平滑肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)至第四代時已經(jīng)發(fā)生了明顯的表型轉(zhuǎn)換[4],因此本研究通過檢測辛伐他汀對體外培養(yǎng)的第四代血管平滑肌細(xì)胞多梳基因Bmi-1的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響,以觀察調(diào)脂藥物是否可以在表遺傳水平發(fā)揮作用,為辛伐他汀的作用機(jī)制提供新的解釋。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器和試劑

    CO2孵箱(Heraeus,Germany);紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer LamBda Bio40,Germany);PCR儀(Biometra,Germany);倒置相差顯微鏡(Nikon,Japan);pH測定儀(4330,JENWAY Ltd,UK);電泳儀和酶標(biāo)儀(BIO-RAD,America);流式細(xì)胞儀(ELITE EST coulter,America);凝膠成像系統(tǒng)(DBT-08,EEC公司)。辛伐他汀、DM EM/F12培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶及RT-PCR試劑盒(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司);四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MT T)和PI染料(Sigma公司);AnnexinⅤ/PI試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

    取8w齡雄性SD大鼠,體重120g左右,購自四川中藥研究所,常規(guī)處死,剖胸取出胸主動脈。分離血管周圍組織,縱向剖開血管,分離中、外膜。將中膜剪成 1 mm×1 mm×1 mm組織塊。添加含有20%小牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7-9d后細(xì)胞達(dá)匯合狀態(tài)時,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代。取第1~4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

    實(shí)驗(yàn)分兩組:對照組和辛伐他汀處理組。對照組:正常生長的第四代平滑肌細(xì)胞;辛伐他汀處理組:不同濃度辛伐他汀(5,10,20,40μ mol?L-1)作用第四代平滑肌細(xì)胞 12、24和36h。

    1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Bmi-1 mRNA

    用Trizol試劑提取各組大鼠VSMC總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。Bmi-1引物序列上游為5'-AGA GAA GCC AAA GGA GGAGGT-3',下游為 5'-GAT GAT TTC CGA GGT CTACTG G-3',擴(kuò)增長度為494bp;內(nèi)參L-19引物序列上游為5'-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG-3',下游為 5'-GGA CAG AGT CT T GAT GAT CTC-3',擴(kuò)增長度為194bp。兩對引物均加入25μ L反應(yīng)體系中,PCR反應(yīng)條件為 94℃變性45s,56℃復(fù)性45s,72℃延伸60s,共35個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)20g?L-1瓊脂糖膠分離后凝膠成像系統(tǒng)攝影,用Gel-pro凝膠定量分析軟件分析RT-PCR產(chǎn)量。

    1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

    取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔2×105的量接種于6孔板,4h后加入終濃度 0、5、10、20、和 40μ mol? L-1的辛伐他汀,藥物處理后12、24和36h在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)。

    1.2.5 四甲基偶氮唑鹽法測定細(xì)胞增殖活力

    分別收集對數(shù)生長期細(xì)胞,用胰酶消化,制成細(xì)胞懸液(5×1012? L-1),加入 96 孔培養(yǎng)板,每孔 200μ L,置 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液,按分組設(shè)計(jì)加入不同濃度(0、5、10、20、和 40μ mol? L-1)辛伐他汀,分別培養(yǎng) 12、24和36h,在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20μ L MT T(5g?L-1),置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中作用4h,除去上清液,加入 150μ L DMSO溶解,平板振蕩儀振蕩10min,酶標(biāo)儀490nm波長檢測各孔吸光度值。以只加培養(yǎng)液不含細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白對照組。

    1.2.6 細(xì)胞周期及凋亡檢測

    選取 24h 作 為時 間點(diǎn),加 入不同 濃度(0、5、10、20、和40μ mol?L-1)辛伐他汀培養(yǎng)細(xì)胞后,用 0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,800 r?min-1離心5min,棄去培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,離心去PBS,加入冰預(yù)冷的 70%乙醇固定,4℃冰箱中保存。染色前以PBS離心沉淀去除固定液,加入PI染色,4℃避光30min,上機(jī)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。同樣用胰酶消化收集不同濃度組辛伐他汀液培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,按照AnnexinⅤ/PI試劑盒說明進(jìn)行操作,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 辛伐他汀對第四代大鼠血管平滑肌細(xì)胞Bmi-1 mRNA表達(dá)水平的影響

    采用RT-PCR檢測Bmi-1的mRNA表達(dá)水平。不同濃度辛伐他汀作用細(xì)胞12、24、36h后,Bmi-1的 mRNA表達(dá)水平隨作用濃度的增加和時間的延長呈下降趨勢(P<0.05,n=3)。(見圖1)

    2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

    加藥前對照組與辛伐他汀加藥組平滑肌細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)基本一致;加藥12、24和 36h后,對照組細(xì)胞生長良好、數(shù)量隨生長時間增長而增多,細(xì)胞大小均勻、形態(tài)一致并呈梭形,高倍鏡下可見細(xì)胞染色質(zhì)疏松、胞質(zhì)豐富。加藥組細(xì)胞培養(yǎng) 12h后,辛伐他汀低濃度組與對照組相比變化不明顯,40μ mol?L-1組可見細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞大小和形態(tài)不均,部分細(xì)胞胞體腫脹變圓。藥物作用24和36h后,各實(shí)驗(yàn)組均可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞大小不一,形態(tài)不規(guī)則,高倍鏡可見細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)減少以及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡,大部分細(xì)胞脫壁呈半懸浮狀態(tài),以上細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)改變隨藥物作用時間的延長和濃度的增加而更明顯(見圖2)。

    2.3 辛伐他汀對平滑肌細(xì)胞生長的抑制作用

    M TT試驗(yàn)顯示,辛伐他汀作用12、24和36h后,各濃度組均出現(xiàn)了不同程度的生長抑制(P<0.05,n=14;見圖3)。

    圖3 不同時間和濃度辛伐他汀對VS MC s的A490值的影響

    2.4 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測

    經(jīng) 5、10、20、40μ mol?L-1的辛伐他汀作用 24h 后,平滑肌細(xì)胞凋亡率明顯增加。細(xì)胞周期檢測顯示G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期細(xì)胞比例明顯降低,顯示細(xì)胞主要阻滯于G0/G1期,且隨著濃度的增高及時間的延長,細(xì)胞凋亡和周期阻滯越明顯(見表1,圖4)。

    3 討論

    近年來,隨著人們生活水平的提高和工作節(jié)奏的加快,心腦血管病的發(fā)病率和病死率都呈明顯的上升態(tài)勢。動脈粥樣硬化是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ),引起動脈粥樣硬化和冠心病的危險因素很多,其中脂質(zhì)代謝紊亂尤為重要。

    表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細(xì)胞周期的影響(,n=3)

    表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細(xì)胞周期的影響(,n=3)

    ▲P<0.05與對照組比較;★P<0.05與不同濃度組間比較。

    組別 凋亡率(%) G0/G1 S空白對照組 8.30±0.95 56.40±3.20 38.67±3.30辛伐他汀5μ mol?L-1組 10.83±1.36 62.10±1.95▲★ 28.53±5.50▲★辛伐他汀10μ mol?L-1組 15.27±2.85▲★ 67.97±2.72▲★ 21.53±3.69▲辛伐他汀20μ mol?L-1組 19.90±0.26▲★ 73.20±1.22▲ 15.87±2.99▲辛伐他汀40μ mol?L-1組 25.50±1.99▲★ 75.43±1.19▲ 12.50±1.40▲

    圖4 24h不同濃度辛伐他汀處理后細(xì)胞周期的變化

    3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的調(diào)血脂藥物。HMGCoA還原酶是細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸(M VA)合成途徑的限速酶,其催化產(chǎn)物MVA及下游產(chǎn)物參與細(xì)胞膜構(gòu)成、糖蛋白合成、電子傳遞、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期進(jìn)展等重要的生物學(xué)功能[5]。他汀類藥物通過對該酶特異性抑制作用,使HMG-CoA不能轉(zhuǎn)變成MVA,從而阻斷膽固醇的合成,降低血膽固醇的水平,已普遍用于臨床治療高脂血癥。近年來的大量研究提示,他汀類除調(diào)脂作用外,還具有調(diào)脂外作用,主要包括改善內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和聚集、誘導(dǎo)凋亡和抑制炎癥反應(yīng),減緩斑塊的形成,減小斑塊大小及穩(wěn)定斑塊等作用[6]。

    他汀類藥物能通過多種途徑抑制細(xì)胞增殖,如:抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成,使質(zhì)膜的構(gòu)成比例變化,導(dǎo)致細(xì)胞通訊連接子的構(gòu)象或功能改變[7];破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[8];下調(diào)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性[9];增加表達(dá)周期素依賴性蛋白激酶抑制因子,導(dǎo)致細(xì)胞在G0/G1阻滯[10]。他汀類藥物誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要在于通過影響M VA途徑而發(fā)揮作用:當(dāng)MVA代謝產(chǎn)物水平下降時,關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的異戊烯化受阻,引起調(diào)控細(xì)胞凋亡的一系列分子表達(dá)改變,包括原癌基因和抑癌基因的產(chǎn)物,從而影響凋亡信號級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

    雖然調(diào)脂治療作用可解釋臨床上應(yīng)用他汀類獲得的較多益處,但更多研究支持他汀類藥物具有調(diào)脂以外的臨床益處,他汀類的非調(diào)脂作用可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。辛伐他汀除了通過以上途徑引起細(xì)胞的增殖抑制和凋亡外,是否在表遺傳方面發(fā)揮作用尚未見報導(dǎo)。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在使用安全用藥濃度范圍內(nèi)的辛伐他汀作用于發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的平滑肌細(xì)胞后,能明顯降低Bmi-1基因的表達(dá),同時抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。這表明辛伐他汀確能通過影響表遺傳調(diào)控過程發(fā)揮抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用,從而揭示了辛伐他汀抗動脈粥樣硬化的另一新的作用機(jī)制。

    1 Zaina S,Dossing KB,Lindholm MW,et al.Chromatin modification by lipids and lipoprotein components:an initiating event in atherogenesis?[J].Curr Opin Lipidol,2005,16(5):549-553.

    2 Lipskaia L,Pourci M-L,Delomenie C,et al.Phosphoinositol 3-kinase and calcium-activated transcription pathway s are required for V LDL-induced smooth muscle cell proliferation[J].Circ Res,2003,92(10):1115-1122.

    3 謝靜,李麗娟,王樹人,等.體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞多梳基因Bmi-1的表達(dá)變化及其與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的關(guān)系[J].中國動脈硬化雜志,2009,17(1):43-47.

    4 王生蘭,蘇娟,徐一洲,等.大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的表型轉(zhuǎn)換及表型鑒定[J].中國動脈硬化雜志,2008,16(4):268-272.

    5 Goldstein JL,Brown MS.Regulation of the mevalonate pathway[J].Nature,1990,343(6257):425-430.

    6 Athyros VG,Kakafika AI,Tziomalos K,et al.Pleiotropic effects of statins-clinical evidence[J].Current Pharmaceutical Design,2009,15(5):479-489.

    7 周永,糜漫天,朱俊東,等.洛伐他汀對MCF-7細(xì)胞增殖分化功能及間隙連接細(xì)胞通訊的影響[J].癌癥,2003,22(3):257-261.

    8 Florio T,T hellung S,Arena S,et al.Somatostatin and its analog lanreotide inhibit the proliferation of dispersed human non-functioning pituitary adenoma cells in vitro[J].Eur J Endocrinol,1999,141(4):396-408.

    9 Holstein SA,Hohl RJ.Interaction of cy tosine arabinoside and lovastatin in human leukemia cells[J].Leukemia Res,2001,25(8):651-660.

    10 Zuckerbraun BS,Shapiro RA,Billiar TR,et al.RhoA influences the nuclear localization of extracellular signal-regulated kinases to modulate p21Waf/Ciplexpression[J].Circulation,2003,108(7):876-881.

    11 Xia Z,T an MM,Wong WW,et al.Blocking protein gerany lgeranylation is essential for lovastatin-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells[J].Leukemia,2001,15(9):1398-1407.

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