蟹源地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 郝向舉 李義＊ 王文娟 郭明凱 孫漢 王玥

益生菌具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道生態(tài)平衡，增進(jìn)健康等重要作用，而芽孢桿菌在惡劣環(huán)境下形成的抗性休眠體芽孢具有耐高溫、耐擠壓、可經(jīng)受顆粒飼料加工過(guò)程中的惡劣環(huán)境，而在儲(chǔ)藏過(guò)程中，芽孢又不會(huì)消耗飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，不影響飼料品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。孢子體耐受酸堿，可避免消化液對(duì)它的破壞，從而順利進(jìn)入宿主腸道。本試驗(yàn)對(duì)河蟹腸道分離出一株對(duì)致病菌有體外抑制能力的地衣芽孢桿菌，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其種子培養(yǎng)基進(jìn)行探討，為河蟹益生菌制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種 地衣芽孢桿菌ESB3，分離自中華絨螯蟹腸道，本實(shí)驗(yàn)室保存（李術(shù)娜等，2009）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，初始pH為7.2的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，從第4小時(shí)開(kāi)始，稀釋平板法測(cè)活菌數(shù)，每隔2 h檢測(cè)一次，直至48 h（王彥波，2009；羅璋等，2007；劉燕，2006；劉瑩等，2006）。

1.2.2 初始pH值對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有 50 mL， 初始 pH 分別為 6.3、6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、9.0 的肉湯培養(yǎng)液的 250 mL 三角瓶中，28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，在前一個(gè)試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)測(cè)其OD600值，重復(fù)3次（王彥波，2009；于明超等，2007；周德慶，2002）。

1.2.3 溫度對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗(yàn)確定的最佳初始pH的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，150 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為 23、28、30、32、37 ℃和 42 ℃， 在第一個(gè)試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)測(cè)其OD600值，重復(fù)3次 （李術(shù)娜等，2009；羅璋等，2007；劉燕，2006；劉瑩等，2006）。

1.2.4 鹽度對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗(yàn)確定的最佳初始pH的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)液其他成分不變，Na-Cl濃度（m/V）分別為 0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，150 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為前面試驗(yàn)確定的生長(zhǎng)最適溫度，在第一個(gè)試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)測(cè)其OD600值，重復(fù)3次 （王彥波，2009）。

1.2.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗(yàn)確定的最佳初始pH、最佳鹽度的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度為前面試驗(yàn)確定的生長(zhǎng)最適溫度，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別為 130、150、170、190 r/min 和 210 r/min， 在第一個(gè)試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)測(cè)其OD600值，重復(fù) 3 次（羅璋等，2007）。

1.2.6 不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽源對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響 選擇不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉）添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使含量為1%（m/V）， 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 配 方 ：（NH4）2SO42.0 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1000 mL；選擇不同的氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏和硝酸銨）添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使含量為1.5%（m/V）， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：K2HPO41.36 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaH2PO42.13 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.5 g，蒸餾水1000 mL；選擇不同的無(wú)機(jī)鹽（NaCl、CaCl2、MgSO4、FeSO4和 K2HPO4） 替代牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的NaCl，使含量為0.5%（m/V）。三個(gè)單因子試驗(yàn)培養(yǎng)條件均為前面試驗(yàn)確定的最佳條件，在最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，重復(fù)3次 （劉瑩等，2006；羅璋等，2007；周德慶，2002；Qi等，2009）。

1.2.7 L9（34）正交試驗(yàn) 以單因子試驗(yàn)最適碳源的3個(gè)濃度1%、1.5%、2%（m/V）， 氮源的 3個(gè)濃度1%、2%、3%（m/V）， 無(wú)機(jī)鹽的 3個(gè)濃度0.3%、0.5%、0.7%（m/V）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。以單因子試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)，稀釋平板計(jì)數(shù)各發(fā)酵液活菌數(shù)（劉瑩等，2006；羅璋等，2007；周德慶，2002；Qi等，2009）。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)影響 結(jié)果見(jiàn)圖1。接種后6 h之前，細(xì)菌活菌數(shù)幾乎無(wú)變化，屬于生長(zhǎng)曲線延滯期，從6～20 h細(xì)菌活菌數(shù)急劇上升，屬于生長(zhǎng)曲線指數(shù)期，從20～36 h細(xì)菌活菌數(shù)波動(dòng)很小，屬于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。36 h后細(xì)菌活菌數(shù)開(kāi)始下降，屬于衰亡期。20 h為指數(shù)期和穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的培養(yǎng)物濃度高，子代培養(yǎng)物的延滯期也短，所以菌株ESB3的最佳發(fā)酵時(shí)間為20 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)影響

2.1.2 初始pH值對(duì)地衣芽孢桿菌ESB3菌株生長(zhǎng)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。pH主要是影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化以及影響營(yíng)養(yǎng)物離子化程度，從而影響菌體對(duì)養(yǎng)分的吸收。pH 7.2、7.5、7.8 的 OD600值顯著高于 pH 8.1、9.0 （P ＜0.05），高于 pH 6.3、6.6、6.9，但差異不顯著（P ＞0.05），綜合顯著性差異分析，菌株ESB3生長(zhǎng)最適pH為7.8。

圖2 初始pH值對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響

2.1.3 溫度對(duì)地衣芽孢桿菌ESB3生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。溫度主要通過(guò)改變酶反應(yīng)速率來(lái)影響菌體的生長(zhǎng)。一般培養(yǎng)基溫度升高，酶反應(yīng)速率增大，生長(zhǎng)代謝加快，生產(chǎn)期提前。但酶本身很容易因過(guò)熱而失去活性，表現(xiàn)為菌體容易衰老，影響最終產(chǎn)量（Saarela等，2000）。本試驗(yàn)中23～30℃時(shí)，地衣芽孢桿菌ESB3的生長(zhǎng)隨溫度升高而上升，而30～42℃時(shí)，則隨溫度上升而下降。綜合顯著性差異分析，地衣芽孢桿菌ESB3的最適生長(zhǎng)溫度為30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響

2.1.4 鹽度對(duì)地衣芽孢桿菌ESB3生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)功能十分重要，可以作為細(xì)胞內(nèi)一般分子成分，也可以調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定pH和作為酶的激活劑 （Verschuere等，2000）。NaCl是最常用的無(wú)機(jī)鹽。0%、0.5%、1%、1.5%、2%濃度組的OD600值無(wú)顯著差異 （P＞0.05），但2%的鹽度下OD600值已經(jīng)有下降的趨勢(shì)，而2.5%組 OD600值顯著變小（P＜0.05）。 這表示NaCl含量由0%～1.5%，鹽度變化對(duì)生長(zhǎng)無(wú)明顯作用，而當(dāng)大于1.5%時(shí)生長(zhǎng)變緩。地衣芽孢桿菌ESB3的適宜培養(yǎng)鹽度為1.5%以下，最適鹽度為1.5%。這一結(jié)果與中華絨螯生活的環(huán)境情況相符。

圖4 鹽度對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響

2.1.5 轉(zhuǎn)速大小對(duì)地衣芽孢ESB3菌株生長(zhǎng)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖5。轉(zhuǎn)速在190 r/min時(shí)，OD600值顯著高于 130、150、210 r/min（P ＜ 0.05），好于 170 r/min，但差異不顯著（P＞0.05）。菌株ESB3的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為190 r/min。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株ESB3生長(zhǎng)的影響

2.2 最適種子培養(yǎng)基研究結(jié)果 不同碳源對(duì)ESB3生長(zhǎng)的影響：結(jié)果見(jiàn)表1。以可溶性淀粉為碳源時(shí)，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為8.01×108CFU/mL，顯著高于其他組 （P＜0.05），組間極差為5.94×108。

表1 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽選擇試驗(yàn)結(jié)果×108CFU/mL

不同氮源對(duì)ESB3生長(zhǎng)的影響：結(jié)果見(jiàn)表1。以胰蛋白胨為氮源時(shí)，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為10.03×108CFU/mL，顯著高于酵母膏和硝酸銨組（P＜0.05），好于蛋白胨和牛肉膏組，但差異不顯著（P ＞ 0.05），組間極差為 2.82×108。

不同無(wú)機(jī)鹽源對(duì)ESB3生長(zhǎng)的影響：結(jié)果見(jiàn)表1。以K2HPO4為無(wú)機(jī)鹽源時(shí)，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為7.08×108CFU/mL。K2HPO4組顯著高于Mg-SO4、 FeSO4組（P ＜ 0.05），好于 NaCl、CaCl2組，但無(wú)顯著差異，組間極差為3.06×108。

L9（34）正交試驗(yàn)：結(jié)果見(jiàn)表 2。 3 因素的極差大小為 K2HPO4（1.84）＞可溶性淀粉（1.64）＞胰蛋白胨（1.43）。極差越大，反映該因素水平變動(dòng)時(shí)，總指標(biāo)變化越大，也就是該指標(biāo)對(duì)綜合指標(biāo)的影響越大。本試驗(yàn)條件下較好的因素搭配水平為可溶性淀粉（2%）、胰蛋白胨（2%）、K2HPO4（0.3%），此時(shí)培養(yǎng)液細(xì)菌濃度可達(dá)11.09×108CFU/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果×108CFU/mL

3 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌ESB3在本試驗(yàn)條件下的最適發(fā)酵時(shí)間為20 h，生長(zhǎng)的適宜初始pH為7.2～7.8，最適pH為7.8，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，適宜培養(yǎng)鹽度為1.5%以下，最適鹽度為1.5%，最適轉(zhuǎn)速為190 r/min。

單因子試驗(yàn)表明，地衣芽孢桿菌ESB3在本試驗(yàn)條件下的最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為可溶性淀粉、胰蛋白胨和 K2HPO4。L9（34）正交試驗(yàn)表明：可溶性淀粉（2%）（m/V）、胰蛋白胨（2%）（m/V）、K2HPO4（0.3%）（m/V）時(shí)地衣芽孢桿菌 ESB3活菌數(shù)最高，達(dá) 11.09×108CFU/mL。

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