溶菌酶對奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原的體外藥敏試驗

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 章偉建

子宮內(nèi)膜炎是奶牛生產(chǎn)中的常見病之一，一旦發(fā)生，導(dǎo)致奶牛配種困難或長期不孕，養(yǎng)殖效率低，甚至提前淘汰。奶牛子宮內(nèi)膜炎的直接病因是病原微生物的感染，這些病原微生物包括細菌、真菌、支原體、霉形體、病毒及寄生蟲等（吳明樓等，2003）。其中，細菌是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要原因（張來英等，1998）。研究表明，從子宮內(nèi)膜炎病牛子宮內(nèi)分離到的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、假單胞菌、變形桿菌、壞死桿菌、綠膿桿菌、生殖器桿菌、嗜血桿菌等（Thomas，2000；Kudriavtser等，1993；Piddock和Wise，1989），不同地區(qū)和不同情況下引起牛子宮內(nèi)膜炎的細菌種類和各種細菌所占的比例不同。

溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，又稱細胞壁溶解酶 （程時軍和劉金銀，2007）。該酶能催化水解細胞壁中位于N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的 β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，細菌內(nèi)容物逸出而使細胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽性菌（G+），在分泌型免疫球蛋白A、補體的參與下，還能水解革蘭氏陰性菌（G-），如大腸桿菌等。此外，它還可與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，使其失活，并能增強抗生素和其他藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達到消炎、修復(fù)組織的目的。

本試驗選取從患有子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮內(nèi)黏液中分離出的主要病原菌金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌和化膿棒狀桿菌，在體外用溶菌酶、慶大霉素、氨芐西林和頭孢唑啉按照微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗,研究溶菌酶對奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療效果。

1 試驗材料

1.1 受試藥物與參照藥物 受試藥物：溶菌酶由上海沈李科工貿(mào)有限公司提供。

參照藥物：慶大霉素、氨芐西林、頭孢唑啉均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 試驗菌株與參照菌株 試驗菌株：從子宮內(nèi)黏液中分離鑒定后的金黃色葡萄球菌37株，鏈球菌30株，大腸埃希氏菌12株，化膿棒狀桿菌22株。參照菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213，鏈球菌ATCC49619，購自中國藥品生物制品檢定所,大腸桿菌ATCC25922，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與試劑 培養(yǎng)基：MH培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰氨酶（ESBLs）檢測試劑盒，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。

試劑：75%乙醇溶液、無菌0.9%氯化鈉溶液、新潔爾滅（1∶1000）溶液。

1.4 實驗室器材 操作室：操作室內(nèi)設(shè)有能達到空氣消毒的紫外燈。試驗前后應(yīng)用75%乙醇溶液噴灑操作臺面及可能污染的死角，開啟紫外燈殺菌1 h。器材：可調(diào)速旋渦混合振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌試管、容量瓶、刻度吸管等、圓底96孔板、接種針或接種環(huán)、鎳鉻絲或一次性無菌塑料制品、無菌衣、褲、帽、口罩，用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌備用或用一次性的無菌物品代替、8頭或12頭微量加液器、吸頭等。

2 試驗方法

2.1 β-內(nèi)酰氨酶檢測 金黃色葡萄球菌產(chǎn)β-內(nèi)酰氨酶檢測按碘量法（徐修禮等，2000）進行。

2.2 大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰氨酶檢測 采用試劑盒進行。

2.3 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的測定 從臨床分離的所有金黃色葡萄球菌中，以苯唑青霉素紙片法（1 μg/mL）篩選所有金黃色葡萄球菌，以抑菌圈≤10 mm為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌即MRSA。

2.4 受試藥物和參照藥物的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定 按微量肉湯稀釋法進行，結(jié)果參照CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定（倪語星等，2005）。

藥液配制：頭孢唑啉、氨芐西林用pH 6.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液作溶劑配制成1280 μg/mL的儲備液，過濾除菌，-20℃低溫保存?zhèn)溆?。慶大霉素用pH 7.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液作溶劑配制成1280 U/mL的儲備液，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。溶菌酶用滅菌蒸餾水配制成1280 U/mL儲備液，4℃存放，使用當(dāng)日配制。

菌液制備：質(zhì)控菌株和鑒定好的試驗菌株接種瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取1～2個單菌落接種于MH培養(yǎng)液，37℃孵育16～18 h，生長濁度達 5×108～ 7.5×108/mL。 將原菌液作 1∶1000稀釋作為試驗菌液。

抑殺菌試驗：將各種藥物儲備液依次倍比稀釋成 256、128、64、32、16 μg/mL（或 U/mL），用微量加液器將稀釋好的藥液按濃度梯度分別加入到每一排孔中，每孔50 μL，第12孔加入不含藥物的空白溶劑作為陰性對照。用微量加液器將試驗菌液依次加入所有試驗孔中，每孔50 μL，這樣每種藥物的最后試驗濃度則為 128、64、32、16、8 μg/mL（或U/mL），第12孔加50 μL MH培養(yǎng)液作為陰性對照。混勻，將微量板放置于37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。以上操作均在無菌條件下。MIC判定：在襯有黑底板的光線下觀察，細菌生長使小孔內(nèi)培養(yǎng)液呈彌散狀渾濁或U型底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀；無細菌生長孔的最低藥物濃度即為該藥物的MIC。MBC測定：MIC測定結(jié)束后，取臨近MIC值無細菌生長的1～3孔培養(yǎng)物涂于瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h后觀察，平板上無細菌生長對應(yīng)孔的最低藥物濃度為該藥物的MBC。

3 結(jié)果與分析

溶菌酶以及三種抗生素對從奶牛子宮內(nèi)黏液中分離的主要病原菌藥敏試驗結(jié)果見表1～4。

由表1可見，溶菌酶對從子宮內(nèi)黏液中臨床分離的金黃色葡萄球菌的MIC為0.004～4 U/mL，MIC50為 0.25 U/mL，MIC90為 1 U/mL；MBC 為125 ～ 8 U/mL，MBC50為 1 U/mL，MBC90為 4 U/mL。溶菌酶對臨床分離的金黃色葡萄球菌慶大霉素耐藥株、氨芐西林耐藥株以及頭孢唑啉耐藥株的MIC和MBC與敏感菌株無明顯差異，且沒有發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株。

由表2可見，溶菌酶對從子宮內(nèi)黏液中臨床分離的鏈球菌的MIC為0.5～8 U/mL，MIC50為2 U/mL，MIC90為 8 U/mL；MBC 為 2 ～ 16 U/mL，MBC50為 4 U/mL，MBC90為 16 U/mL。

由表3可見，溶菌酶對從子宮內(nèi)黏液中臨床分離的大腸埃希氏菌的MIC范圍為4～64 U/mL和＞128 U/mL，MIC50為64 U/mL；因本試驗數(shù)據(jù)中MIC大于128 U/mL的菌株數(shù)達4株，故無法計算MIC90，初步可判定溶菌酶對臨床分離的大腸埃希氏菌很難達到90%的抑菌數(shù)，或者是該濃度

大大超過本試驗所設(shè)計的濃度梯度范圍。MBC范圍為16～64 U/mL和＞128 U/mL，同樣的道理，無法計算MBC50和MBC90。對慶大霉素、氨芐西林及頭孢唑啉耐藥的大腸埃希氏菌株的MIC與敏感菌株無明顯差異；對大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰氨酶（ESBLs）株和不產(chǎn)酶株的抑制作用無差別。

表1 溶菌酶以及三種抗生素對奶牛子宮內(nèi)黏液中分離的金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

表2 溶菌酶對奶牛子宮內(nèi)黏液中分離的鏈球菌藥敏試驗結(jié)果U/mL

表3 溶菌酶對奶牛子宮內(nèi)黏液中分離的大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

由表4可見，溶菌酶對從子宮內(nèi)黏液中臨床分離的化膿棒狀桿菌的MIC為0.5～64 U/mL和＞ 128 U/mL，MIC50為 32 U/mL，MIC90為 64 U/mL；MBC 為 2～128 U/mL和＞ 128 U/mL，MBC50為 64 U/mL，MBC90為 128 U/mL。

表4 溶菌酶對奶牛子宮內(nèi)黏液中分離的化膿棒狀桿菌藥敏試驗結(jié)果U/mL

4 討論

4.1 溶菌酶對大腸埃希氏菌的弱抑菌力不影響臨床效果 由于溶菌酶主要對G+的抑殺作用較強，從本次試驗中也表明其大腸埃希氏菌抑殺力不如對其他病原菌強，但臨床上由于引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌常常是金黃色葡萄球菌、鏈球菌、變形桿菌、多殺巴氏桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌等混合菌群（吳明樓等，2003），而不同地區(qū)致病菌群中各病菌占取比例并不一樣 （王志國等，1998），患病奶牛往往不是由單一的致病菌而是多種病菌侵入而導(dǎo)致的綜合性癥狀 （吳明樓等，1996）。同時，由于對溶菌酶本身的工藝進行了較大的改進，使其對G-也產(chǎn)生了較廣的抑菌譜，因此，臨床上對于具體的患病奶牛的致病菌群抑殺力不會有明顯影響。

4.2 溶菌酶對已經(jīng)產(chǎn)生抗生素耐藥性的病原微生物表現(xiàn)出較好的敏感性 從本次試驗中可以發(fā)現(xiàn)，溶菌酶對臨床分離的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的慶大霉素耐藥株、氨芐西林耐藥株以及頭孢唑啉耐藥株的MIC與敏感菌株無明顯差異，對大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰氨酶（ESBLs）株和不產(chǎn)酶株的抑制作用也無差別，表明溶菌酶對已經(jīng)產(chǎn)生抗生素耐藥性的病原微生物表現(xiàn)出了較好的敏感性。

4.3 溶菌酶在畜牧業(yè)生產(chǎn)中將會有廣闊的應(yīng)用前景 盡管目前對溶菌酶的研究和應(yīng)用尚處于起步階段，但是，隨著酶工程的發(fā)展進步，人們正研究用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)溶菌酶，同時還采用酶修飾法先后合成了溶菌酶-環(huán)糊精和溶菌酶-半乳甘露聚糖，經(jīng)過修飾后的溶菌酶不僅抗菌活性穩(wěn)定，而且具有良好的乳化性能。此外，由于溶菌酶抗菌譜較窄，只對G+起作用，為了加強其溶菌作用，常與甘氨酸、植酸、聚合磷酸鹽等物質(zhì)配合使用，以增強對G-的溶菌作用（朱奇和陳彥，1998）。隨著殺菌譜廣、成本低、安全性高的溶菌酶的開發(fā)，溶菌酶在畜牧業(yè)生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越大的作用。

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