中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種的篩選與發(fā)酵條件研究

湖南農業(yè)大學生物科學技術學院 蘭時樂 李立恒 胡 超 林元山 謝達平

中草藥飼料添加劑屬于天然藥物，大量研究表明，中草藥飼料添加劑具有促進動物生長發(fā)育、提高飼料利用率、改善畜禽產品質量、增強動物免疫功能等作用（李洪龍等，2007；劉根新等，2007；王麗輝等，2007；李宗輝等，2002；唐建安等，2000），其研究和應用已受到國內外研究工作者的廣泛關注。但由于中草藥飼料添加劑的應用和研究存在用藥成分復雜、含量低、適口性差、效果不穩(wěn)定、用量大且難以掌握、毒副作用等問題，阻礙了中草藥飼料添加劑的規(guī)?；茝V應用。微生物發(fā)酵中草藥飼料添加劑是利用微生物的降解作用，將中草藥中的有效成分、活性物質最大限度地釋放出來，并對中草藥活性成分進行修飾產生新的活性物質。微生物在生長代謝過程中，可以產生各種各樣的防病助生長的次生代謝產物，可將動物難以消化吸收的大分子物質轉化成易于吸收的小分子物質，還可產生各種不同的酶，從而促進動物生長發(fā)育，縮短飼養(yǎng)周期，提高飼料報酬率，增強藥效和降低飼養(yǎng)成本等。本文采用從不同中草藥中分離能夠發(fā)酵中草藥的微生物，對中草藥復方進行發(fā)酵，并測定了中草藥復方發(fā)酵前后抑菌活性和纖維素酶、酸性蛋白酶活力的變化規(guī)律，以期為開發(fā)發(fā)酵型中草藥飼料添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥：青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草、紫草、金銀花、板藍根等中草藥，購于長沙市汽車東站中藥材市場，無霉變和蟲蛀。低溫烘干，粉碎后，過40目篩，備用。

供試菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌 （Salmonella typhimurium）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 中草藥飼料添加劑浸煮液的制備 稱取適量的中草藥飼料添加劑復方，加入20倍的蒸餾水，煎煮30 min后粗過濾，取濾液于8000 r/min離心15 min，取上清液，減壓濃縮5倍，備用。

1.2.3 霉菌分離培養(yǎng)基 馬丁氏固體培養(yǎng)基 （沈萍和陳向東，2007）中加入0.8%去氧膽酸鈉和5%中草藥飼料添加劑水煮液，pH自然。

1.2.4 液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖5%，豆餅粉1.5%，酵母粉 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCO30.4%。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 中草藥飼料添加劑復方90%，麥麩5%，葡萄糖 3%，（NH4）2SO41.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.2%。

1.3 方法

1.3.1 中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種篩選 分別稱取10 g粉碎至40目的青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等不同中草藥于90 mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩15 min后，適當稀釋。分別取0.1 mL不同稀釋度的中草藥稀釋液于細菌和霉菌分離培養(yǎng)基平板中央，涂布均勻。細菌平板在37℃培養(yǎng)48 h，霉菌平板在28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d進行初篩。將初篩得到的菌株采用平板劃線法分離純化后，分別接種于加有20%中草藥飼料添加劑浸煮液的細菌和霉菌培養(yǎng)基中進行復篩，將復篩得到的菌株于4℃冰箱中保存待用。

1.3.2 培養(yǎng) 菌種活化：將供試菌株和Y-1接種于牛肉膏蛋白胨和PDA培養(yǎng)基斜面上，分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，備用。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)成熟的斜面菌種Y-1接種于液體種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

2）退出控制電源、儲能電源后，繼保人員手動復歸，兩信號消失。投分一次控制電源后，“告警”信號又出現(xiàn)，且無法復歸。保護裝置掉電重啟后，告警信號可手動復歸。再次分投一次控制電源，告警信號再次無法手動復歸。

中草藥飼料添加劑的發(fā)酵：按配方稱取中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基30 g于250 mL三角瓶中，自來水調節(jié)含水量50%，充分拌勻，110℃滅菌 30 min后，按10%（V/m）的接種量接種培養(yǎng)好的液體種子，28℃培養(yǎng)96 h，50℃烘干。同時以接種無菌水為對照。

1.3.3 發(fā)酵條件的研究 培養(yǎng)方法同1.3.2，替換不同的條件，如中藥與麥麩的不同比例、碳源的種類、氮源的含量、起始pH值、含水量、溫度等，考察Y-1霉菌發(fā)酵中草藥飼料添加劑后對抑菌效果的影響及Y-1霉菌的產酶規(guī)律。

1.3.4 抑菌試驗及酶活測定 發(fā)酵樣品處理：稱取10 g不同菌種的發(fā)酵物和各組對照物，加入200 mL蒸餾水，煮沸15 min后，3000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣加入200 mL蒸餾水提取后，離心，合并上清液，真空減壓濃縮至每毫升含1 g生藥。

抑菌試驗：取培養(yǎng)16～18 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌新鮮培養(yǎng)液5 mL，分別加入100 mL冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，混合均勻后，在直徑為9 cm的標準培養(yǎng)皿中準確吸入15 mL含菌培養(yǎng)基，冷卻成含菌平板。每個平板上放置3個滅菌的牛津杯，牛津杯中加入40 μL中草藥飼料添加劑發(fā)酵浸提液。37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的大小。每處理設3次重復。同時以未接種的為對照。

酶活測定：（1）粗酶液制備：稱取經低溫烘干的固體中草藥發(fā)酵劑1.00 g于100 mL pH 4.8的磷酸緩沖液中，40℃ 浸提2 h，濾紙過濾，4000 r/min離心15 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）纖維素酶活力測定：參照Vallander和Erik（1985）提供的方法并略作修改進行測定。（3）羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定：于25 mL具塞試管中加入濃度為 1%CMC-Na-醋酸緩沖液（pH 4.8）1.8 mL，加入0.2 mL粗酶液，50℃保溫30 min后，加入3.0 mL DNS試劑，水浴煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水定容，搖勻，于540 nm處測定光密度值。酶活定義：在反應條件下，30 min水解羧甲基纖維素鈉產生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）；（4）FPA活力測定： 于 25 mL具塞試管中加入pH 4.8的醋酸緩沖液1.8 mL、新華濾紙50.0 mg以及酶液0.2 mL，50℃保溫60 min后，加入3.0 mL DNS試劑，其他同CMCase酶活測定。酶活定義：在反應條件下，每60 min水解濾紙產生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）。（5）酸性蛋白酶活力測定：參照姜錫（1999）提供的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種的篩選 從青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等中草藥中共分離出22株微生物菌株，其中細菌14株，霉菌8株。將純化的菌株點種在含藥濃度逐步遞增的固體培養(yǎng)基平板上，通過多次反復篩選，得到一株在中藥復方中生長良好、發(fā)酵能力較強的菌株，初步鑒定為米曲霉Y-1。

2.2 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對Y-1霉菌產酶的影響及抑菌效果的影響 分別配制中藥與麥麩不同比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）的發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%（V/W）接種量接種Y-1種子培養(yǎng)液，28℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定酶活，同時提取發(fā)酵液進行抑菌實驗，結果見表1、圖1。

從表1可以看出，中草藥飼料添加劑中添不同比例的麥麩發(fā)酵后對四種供試菌的抑菌效果都有不同程度的增加。當中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時，發(fā)酵物料的蒸煮液對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分別增加38.61%、22.32%、27.93%和11.4%。從產酶效果來看（如圖1），在一定范圍內，隨著麥麩比例的增加，纖維素酶的活力增強，當中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時，CMCase酶活達9870 U/g，F(xiàn)PA酶活為892 U/g，主要原因為中草藥中含有大量的纖維素，能夠誘導真菌纖維素酶的分泌，高纖維素酶活力可以破壞中草藥的細胞壁，導致中草藥有效成分的充分釋放，從而提高了中草藥發(fā)酵后的抑菌效果。而蛋白酶的酶活隨著麥麩含量的增加而增加，主要原因為麥麩中含有一定量的蛋白質，可以誘導蛋白酶的合成和分泌。綜合抑菌效果和各種酶的含量，以下試驗均選擇中草藥飼料添加劑和麥麩的比例為7∶3。

表1 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對抑菌效果的影響

圖1 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對酶活的影響

2.3 不同碳源對Y-1霉菌產酶的影響及抑菌效果 在其他條件相同的情況下，向培養(yǎng)基中分別加入1%的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖，以不加其他碳源為對照，28℃恒溫培養(yǎng)120 h，測定纖維素酶和蛋白酶的酶活，并測定抑菌活力。結果分別見表2和圖2。

從表2中可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的不同碳源，可以明顯提高發(fā)酵中草藥飼料添加劑的抑菌效果。在添加的四種碳源中，以添加葡萄糖的處理，發(fā)酵物料蒸煮液的抑菌效果最好，其次是蔗糖。與對照相比，添加葡萄糖對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris 的抑菌效果分別提高了18.6%、24.79%、31.48%、17.6%。從圖2中可以看出，葡萄糖為碳源時，發(fā)酵后物料的CMCase酶、FPA酶和蛋白酶的活力最高，分別達到9017、1062 U/g和7793 U/g，蔗糖次之。說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量葡萄糖，可以促進霉菌Y-1的生長和酶的分泌。

2.4 培養(yǎng)溫度對抑菌效果和酶活力的影響 將中草藥飼料添加劑培養(yǎng)物分別置于不同的溫度（28、30、32、35 ℃和 37 ℃） 下恒溫培養(yǎng) 120 h，測定酶活和抑菌活性。結果分別見表3和圖3。

表2 不同碳源對抑菌效果的影響

圖2 不同碳源對酶活的影響

從表3可知，培養(yǎng)溫度在28～32℃時，隨著溫度的升高，發(fā)酵物料的抑菌作用也隨之提高，當培養(yǎng)溫度為32℃時，發(fā)酵物料對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌活性較 28 ℃發(fā)酵時分別提高 19.08%、16.94%、9.42%和12.6%。但培養(yǎng)溫度超過32℃，抑菌作用隨著培養(yǎng)溫度的升高而下降。不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶和蛋白酶的酶活影響也很大，CMCase酶活和蛋白酶酶活在32℃時最高，隨著培養(yǎng)溫度升高，酶活降低較為明顯；FPA酶活在28～35℃變化不是很明顯，但培養(yǎng)溫度超過37℃，酶活同樣降低（見圖3）。因此確定培養(yǎng)溫度為32℃。2.5 起始pH對抑菌效果和酶活的影響 在上述的基礎上，選擇不同的起始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）進行發(fā)酵，考察不同起始 pH 條件下抑菌效果及酶活變化規(guī)律。結果見表4和圖4。

表3 不同培養(yǎng)溫度對抑菌效果的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

表4和圖4表明，發(fā)酵物料的初始pH值在6.0～7.0，對供試菌的抑菌效果變化不顯著；而纖維素酶和蛋白酶酶活在pH 6.0～6.5保持較高的酶活力。因此，在發(fā)酵前可不需調節(jié)發(fā)酵物料的pH值，采用自然pH值即可。2.6 物料含水量對抑菌效果和酶活的影響 分別調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為30%、40%、50%、60%、70%，其他條件不變，考察不同含水量發(fā)酵條件下的抑菌效果和酶活變化。結果見表5和圖5。

表4 起始pH值對抑菌效果的影響

圖4 起始pH值對酶活的影響

水是任何生物在生命活動過程中不可缺少的物質。固體基質中水分含量太少，會影響微生物對物質的分解利用和微生物的代謝活動；水分含量太高，會影響原料顆粒之間的松散性，使原料顆粒成團，影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，并容易造成厭氧環(huán)境。從表5可以看出，當發(fā)酵物料的含水量為50%時，對四種供試菌的抑菌活性最高；從產酶的變化規(guī)律分析，CMCase酶和蛋白酶酶活力在含水量為60%時，酶活最高，分別達到8107 U/g和3158 U/g，而FPA酶活在含水量為50%時最高，達到1857 U/g（見圖5）。為生產實際考慮，發(fā)酵物料的含水量控制在50%～60%為宜。

表5 含水量對抑菌效果的影響

圖5 含水量對酶活的影響

2.7 發(fā)酵時間對抑菌效果及酶活的影響 將中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)不同時間（24、48、72、96、120 h），其他條件不變，取樣低溫干燥后測定抑菌效果和酶活。結果見表6、圖6。

從試驗結果可以看出，發(fā)酵時間對酶的產量和抑菌效果影響較大。發(fā)酵前期，主要是微生物生長階段，隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物酶特別是纖維素酶合成量加大，中草藥細胞壁破壞程度加劇，使中草藥中有效成分逐步釋放出來，到發(fā)酵72 h，中草藥飼料添加劑發(fā)酵物料對四種供試菌的抑制效果較發(fā)酵前分別增加60.83%、41.32%、36.03%和27.64%，但發(fā)酵時間超過72 h，抑菌活性下降，原因可能為部分中草藥有效成分被微生物酶修飾或被微生物轉化為其他產物。從發(fā)酵時間對產酶規(guī)律的影響分析，發(fā)酵第96 h產酶達到高峰，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分別達到9653、971 U/g和6357 U/g。綜合發(fā)酵物料的抑菌活性，確定發(fā)酵時間為72 h。

3 結論

3.1 通過在分離培養(yǎng)基中加入中草藥提取液，從中草藥青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、膽草、夏枯草等中草藥中篩選到1株能發(fā)酵中草藥飼料添加劑的菌株，初步鑒定為米曲霉Y-1。

表6 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響

圖6 發(fā)酵時間對酶活的影響

3.2 通過對中草藥飼料添加劑發(fā)酵條件的研究，確定了中草藥飼料添加劑合適的發(fā)酵條件為：中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3、葡萄糖1%、發(fā)酵溫度32℃、初始pH自然、物料含水量50% ～60%、發(fā)酵周期為72 h。在此條件下，發(fā)酵料蒸煮液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性分別較對照提高 36.03%、60.83%、27.64%、41.32% ，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分別達到9653、971 U/g和 6357 U/g。

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