槲寄生堿抗胰腺癌作用的實驗研究*

姚俊濤 王一羽 原 榮 李 軍 孫 莉 胡玉琴 袁 彬 陜西省腫瘤醫(yī)院(西安 710061)

胰腺癌是一種兇險的惡性腫瘤,近年發(fā)病有上升趨勢,目前治療包括以手術(shù)為主,放射治療為輔的綜合治療,但是患者痛苦大 ,預(yù)后極差。槲寄生作為一種傳統(tǒng)中藥,具有祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋骨、安胎等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),槲寄生是一種天然的抗腫瘤藥物,但至今未見槲寄生生物堿與胰腺癌相關(guān)的研究。我們采用常規(guī)方法從槲寄生中提取生物堿,研究其對人胰腺癌細(xì)胞 PC-3的增殖、凋亡作用,并初步探討其可能的機制,為胰腺癌的治療提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

1 實驗材料 1.1 細(xì)胞株 胰腺癌細(xì)胞株 PC-3購自第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞庫。

1.2 藥物 槲寄生藥材經(jīng)陜西省藥品檢驗所鑒定。選用常規(guī)實驗方法,主要從定性方面進行實驗,先在酸性水溶液中浸泡粉碎后的槲寄生藥材,然后再用堿性沉淀的方法提取出生物堿。具體過程為:選擇槲寄生藥材—粉碎—在酸性溶液中浸泡 48h—過濾—濾液加堿沉淀—出去不溶解部分—再加堿沉淀—其沉淀物即是總堿。在提取過程中,用不同堿度的溶液進行沉淀處理后,得到幾種不同生物堿。將提取物以碘—碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑—檢驗均呈陽性反應(yīng),證明提取物均為槲寄生堿。

1.3 試劑 RPM I1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購于美國 Gibco公司;M TT為 Sigma公司產(chǎn)品。小鼠抗人 Bcl-2 FITC檢測試劑、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為 BD公司產(chǎn)品。氟尿嘧啶(5-FU)為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

2實驗方法 2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC-3細(xì)胞用含 10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液在 37℃、5%的 CO2條件下培養(yǎng)。 0.25%胰酶消化傳代,2～ 3d更換培養(yǎng)。

2.2 M T T法藥物敏感實驗 取對數(shù)期生長的 PC-3細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個 /mL,鋪到 96孔培養(yǎng)板培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的藥物,并設(shè)定陰性對照 (不含藥物,只含配置藥物的乙醇),陽性對照 (含不同濃度的 5-FU),空白對照(不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)。孵育 48h后,每孔加入 20 μl M T T液,繼續(xù) 37℃孵育 4h后,吸去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞颯 150μl,震動 10min后,在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度值(實驗波長492nm,參考波長 620nm)。抑制率(%)=(未處理藥物的 A492值-藥物處理的 A492)/未處理藥物的 A492值×100%。以藥物對數(shù)濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)作圖,得出抑制 50%細(xì)胞生長的濃度(IC50)。

2.3 Bcl-2和細(xì)胞凋亡的檢測 AnnexinⅤ -FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。 PC-3細(xì)胞中分別加入 3個濃度組的槲寄生堿溶液,分別為 11.50,23.00,46.00μg/mL,另設(shè)陰性對照不加藥組。藥物作用 48h后 ,收集細(xì)胞,用 4℃預(yù)冷的 PBS洗細(xì)胞兩次,用 250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/mL;取 100μL的細(xì)胞懸液于 5mL流式管中,加入5μLAnnexin V/FITC和 10 μL 20ug/mL的碘化丙錠溶液;混勻后于室溫避光孵育 15min;在反應(yīng)管中加 400 μL稀釋好的結(jié)合緩沖液,及時上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。另取 100 μL細(xì)胞懸液,用含 70%乙醇的 PBS1mL滲透細(xì)胞 30min,沖洗 2次,棄上清。用 100 μL PBS重懸細(xì)胞,加小鼠抗人 BCL-2 FITC 5 μL,4℃下孵育 20min,加入 PBS,進行流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行,實驗組與對照組用 t檢驗。

3 實驗結(jié)果 3.1 PC-3細(xì)胞對槲寄生堿的敏感性槲寄生堿對 PC-3細(xì)胞的生長有抑制作用,且抑制作用隨堿濃度的升高而增加。當(dāng)槲寄生堿的濃度為 92.00、46.00、23.00、11.50、5.75、2.88、 1.44、 0.72μ g/mL時 ,對 PC-3細(xì)胞的抑制率分別是(82.6±0.22)%、(81± 0.98)%、(70± 0.66)%、(59.4±1.34)%、(38.8±1.09)%、(34.5±2.01)%、(17.6±1.24)%、(8.1±1.12)%。槲寄生堿對 PC-3細(xì)胞的 IC50為 8.64 μg/mL,陽性對照 5-FU的濃度為 50.00、25.00、 12.50、6.25、 3.13、1.56、0.78、 0.39μ g/mL時 ,對 PC-3細(xì)胞的抑制率分別是 (97.6±1.02)%、(92.5±0.79)%、(77.2±0.23)%、(62.5±0.79)%、(45.2±1.22)%、(12.4± 1.42)%、(5.2±2.00)%、(0.3±1.35)%。 5-FU對 PC-3細(xì)胞的 IC50為 4.59μg/mL。

3.2 槲寄生堿對 Bcl-2表達(dá)的影響 與沒有加入槲寄生堿的 PC-3細(xì)胞相比 ,加入槲寄生堿的細(xì)胞 Bcl-2表達(dá)率明顯降低(P ＜0.05),并且降低程度隨槲寄生堿劑量的升高而增加。未加入槲寄生堿的 PC-3細(xì)胞 Bcl-2的表達(dá)率是(72.56±0.98)%,當(dāng)槲寄生堿的濃度為 11.50、 23.00、46.00 μg/mL時 ,PC-3細(xì)胞的 Bcl-2表達(dá)率分別是(30.26±1.02)%、(21.76±0.87)% 、 (16.41± 1.11)%(見圖 1)。

3.3 槲寄生堿對細(xì)胞凋亡的影響 與沒有加入槲寄生堿的 PC-3細(xì)胞相比,加入槲寄生堿凋亡率明顯增加(P＜0.05),并且凋亡率隨槲寄生堿劑量的升高而增加。未加入槲寄生堿的 PC-3細(xì)胞凋亡率是(0.84±0.81)%,加入槲寄生堿的濃度為 11.50、23.00、46.00μg/mL時,PC-3細(xì)胞的凋亡率分別是(25.20± 1.23)%、 (39.24± 0.66)%、 (68.61± 1.10)%(見圖2)。

4 討 論 胰腺癌是消化系統(tǒng)具有高度惡性的腫瘤,起病隱蔽,不易早發(fā)現(xiàn),進展迅速 ,手術(shù)切除率僅 15%,5年生存率不足 4%,嚴(yán)重威脅人類健康,且發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢。胰腺癌治療仍然以手術(shù)為主,放化療為輔的綜合治療。副作用大且預(yù)后極差。所以積極尋找治療胰腺癌的新方法成為當(dāng)務(wù)之急。

槲寄生屬植物為桑寄生科半寄生常綠小灌木,是中國的傳統(tǒng)中藥,其成分主要有:槲寄生凝集素、槲寄生毒素、生物堿、黃酮類化合物等,具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松、降血壓、降血糖等藥理作用。近年來發(fā)現(xiàn)槲寄生還具有抗腫瘤的作用,葉孟,林蕾等報導(dǎo)槲寄生對 HCT116細(xì)胞的生長有明顯抑制作用,并使人大腸癌細(xì)胞 HCT116周期阻止在 G2/M期[1],并可以通過抑制 NF-κBp活性來誘導(dǎo)人大腸癌HCT116細(xì)胞凋亡[2]。郭艷杰報導(dǎo)槲寄生生物堿可能通過對抑癌基因 P53表達(dá)來抑制人肝癌細(xì)胞株 SMM C-7721的生長[3]。李亞娟發(fā)現(xiàn)槲寄生堿可以抑制人腺樣囊性癌細(xì)胞 ACC的生長、增殖[4]。

在歐洲,槲寄生已被作為一種有效的抗腫瘤輔助治療應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)在市場上出售的成品藥劑主要有 Iscador,Eurixor,Helixor,Isorel等。做為有效的輔助治療手段。關(guān)于槲寄生在腫瘤治療中的應(yīng)用研究及其機制仍在不斷展開中,Gardin NE將槲寄生應(yīng)用于腫瘤患者,兩周后對比測患者用藥前后的白細(xì)胞計數(shù)、CD4+和 CD8+T淋巴細(xì)胞、補體 C3和 C4、免疫球蛋白A、G和 M等指標(biāo),證實槲寄生能夠提高腫瘤患者的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[5]。Seifert G報道槲寄生在體外通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺傷急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞細(xì)胞系 NALM-6,并在小鼠體內(nèi)實驗獲得了同樣的結(jié)果,顯著提升了小鼠的存活時間,并且沒有發(fā)現(xiàn)任何副作用[6]。Sabova L發(fā)現(xiàn)槲寄生提取物不但能夠抑制 Jurkat細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)其凋亡,而且與阿霉素具有協(xié)同殺瘤作用[7]。Wode K等報道了槲寄生提取物能夠?qū)鼓[瘤相關(guān)疲勞(Cancer-related fatigue,CRF),提升患者的生活質(zhì)量,并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)[8]。本實驗通過 M TT方法測得槲寄生堿對胰腺癌細(xì)胞 PC-3的 IC50為 8.64 μg/mL,5-FU對PC-3細(xì)胞的 IC50為 4.59 μg/mL。 結(jié)果表明槲寄生對 PC-3細(xì)胞的生長有抑制作用。

Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子,主要定位于核膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜。Bcl-2基因表達(dá)能夠阻斷多種細(xì)胞凋亡途徑的共同通道,抑制凋亡,增加細(xì)胞染色體畸變和病毒感染機會,導(dǎo)致細(xì)胞惡變和促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Bcl-2表達(dá)于多種實體腫瘤,如乳腺癌,結(jié)腸癌 ,肺腺癌、卵巢癌等,在胰腺癌中也有較高的表達(dá)率。并且影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和對放化療的抵抗[9]。 Okamoto K等用特異的 Bcl-2 siRNA使 Bcl-2基因沉默,能夠在體外提高胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[10]。本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測槲寄生堿對 PC-3細(xì)胞的凋亡率和 Bcl-2的表達(dá),結(jié)果顯示隨著槲寄生堿作用濃度的增大,細(xì)胞凋亡率越來越高,Bcl-2表達(dá)率越來越低,各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明槲寄生能夠能夠促進胰腺癌細(xì)胞的凋亡,并且對 Bcl-2有明顯的抑制作用。降低 PC-3細(xì)胞中 Bcl-2的表達(dá)可能是其促進細(xì)胞凋亡的原因。

本研究證實槲寄生堿抑制胰腺癌癌細(xì)胞 PC-3增殖,其誘導(dǎo)凋亡的機制可能與干擾下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。作為一種分布廣、造價低廉、毒副作用的天然藥物,槲寄生在胰腺癌治療領(lǐng)域有良好的臨床應(yīng)用前景,但其具體機制仍需進一步研究。

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[3] 郭艷杰,周立社,孔凡青,等.槲寄生生物堿通過P53途徑抑制肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721的研究[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,24(3):227-229.

[4] 葉 孟,林 蕾,王少敏,等.槲寄生對人大腸癌HCT116細(xì)胞細(xì)胞周期作用的研究 [J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2007,19(10):780-784.

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