電針對大鼠脊髓損傷后 Slit2表達的影響*

尹明錫 宋金鈴 時素華 宋 萌 耿 直 鄭光華 李志剛 北京中醫(yī)藥大學(xué)(北京 100029)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)指因直接暴力或間接暴力作用在正常脊柱和脊髓組織,致?lián)p傷平面以下脊髓各項功能,包括運動、感覺、括約肌和反射功能障礙 ,是人類致殘率最高的疾患之一,損傷修復(fù)也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題。督脈電針治療 SCI有較好的臨床療效已得到醫(yī)學(xué)界廣泛的認可,但其具體作用機制尚不完全清楚。督脈電針是電針中最常用的一種 ,治癱首取督脈[1-2]。本實驗通過 RT-PCR研究SCI后 Slit2 mRN A的表達 ,探討針刺治療 SCI作用機制 ,旨在為臨床針灸治療脊髓損傷后提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法 1.1實驗動物及分組 雄性健康 SD大鼠 72只,體重 240±20g,由北京維通利華動物中心提供。隨機分為空白組,模型組,電針組,藥物組。每組各 18只,每組再隨機分為三個時間組,6h、1d和 7d組。

1.2 針具 針灸針用華佗牌無菌針灸針,規(guī)格:0.30×13mm。電針用韓氏(HAN S)電針儀,型號 LH-202H。

1.3 脊髓損傷動物模型制作 用 10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉,固定于自制的弓形手術(shù)臺上。按肋骨確定椎體序列,大鼠背部最下端肋骨緣橫對 T13為標志,向上依次定位 T9-T11。背部脫毛劑脫毛;分離背部肌肉,沿深筋膜肌肉附著點剪開深筋膜,暴露棘突和椎旁肌肉;用刀片自棘突向兩側(cè)順次剝離椎旁軟組織,暴露 T9-T11段棘突和椎板;用組織鉗咬住 T10棘突輕輕上提,顯露 Tl0T11椎間隙,彎眼科剪剪除T10椎板及其上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突,暴露脊髓;參照經(jīng)典的改良式的 Allen’s打擊方法,用自制的打擊器打擊 T10段脊髓5cmx10g,立即移去打擊器,模型成功標準是:鼠尾持續(xù)劇烈擺動數(shù)秒,雙下肢及背部肌肉瞬時收縮,硬脊膜下出血,麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。

1.4 治療 電針組于造模后大約半小時即大鼠蘇醒后先行 CBS評分,再選取“大椎”(DU14;第 7頸椎棘突下,向下斜刺 )、“命門”(DU4;第 2腰椎棘突下,向上斜刺)進行針刺治療,進針約 0.5-0.7cm。使用韓氏 LH-202H型穴位神經(jīng)刺激儀,大椎穴接陰極 ,命門穴接陽極,持續(xù)脈沖電流,頻率 2Hz,治療時間 20min,輸出強度在剛開始時以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度,待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。電針組每天同一時間重復(fù)治療一次。

藥物組于造模后以 30mg/kg體重的甲基強的松龍尾靜脈注射。藥物組于第二天同一時間以 5.4 mg/kg體重的甲基強的松龍尾靜脈重復(fù)注射一次,之后再不給藥。

空白組和病理組不做任何治療,但要在同一時間均抓取一次,以保證應(yīng)激條件相同。

1.5 動物取材 造模后 6h、1d、7d取空白組、模型組、電針組及藥物組大鼠各 6只,動物處死后,迅速置于冰盤上取脊髓損傷區(qū) 1cm約 50mg的脊髓組織,置于勻漿器中,加入 Trizol試劑 lmL勻漿,冰上作用 l0min。

1.6 指標的檢測 總 RN A抽提試劑盒 Trizol購自Invitrogen(GIBCO公司 ,USA),USA)。 Slit2、Nogo-A特異性引物由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成(采用 Primer5.0引物設(shè)計軟件)Slit2上、下游引物序列分別為 5CTTgCCCAT CAATgCCTTCTCCTA-3和5 gCAgCCgCACTTCACCACT T TCTC-3,擴增產(chǎn)物長度 410bp;β-action為內(nèi)參照,上、下游引物5 rGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3和5 GATGCAGG GATGATGTTC-3,擴增產(chǎn)物長度 356bp。參照 GIBCO公司RN A抽提試劑盒說明提取總 RN A,紫外分光光度計測定總RN A含量,-70℃保存。取總 RNA2uL,按照 PCR反應(yīng)試劑盒操作進行 ,RT反應(yīng):采用 20μL反應(yīng)體系,Total RN A2 μL,Oligo(dt)primer 1 μL,H2O14.5ul,M Buffer 5.0 μL,dN TPS 1.0μL,RNase Inhibitor0.5 μL,M-MLV(反轉(zhuǎn)錄酶 )1.0μL,輕度離心 3～ 5s,反應(yīng)條件為 42℃60min,95℃5min,4℃保溫或 -20℃保存?zhèn)溆谩?PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min,然后 94℃、56℃、72℃分別 30 S,30循環(huán),最后 72℃延伸 8 min。 瓊脂糖凝膠電泳觀察 PCR產(chǎn)物,使用凝膠圖像分析軟件 Bandscan4.5測定實驗組 Slit2條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值,以兩者的比值表示 RT-PCR實驗組產(chǎn)物的相對含量,進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計分析采用 SAS軟件進行。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較采用方差分析。以P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)差異顯著性的標準。

2 結(jié) 果 圖像中空白組、模型組、電針組、藥物組 6h、1d、7d的 RT-PCR檢測結(jié)果各得到一條 410bp(Slit2)的擴增產(chǎn)物 (圖 1～ 3)。

2.1 根據(jù)結(jié)果分析統(tǒng)計 造模后 6h:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRNA基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRN A基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2mRNA基因表達互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異(P＞0.05)。

造模后 1d:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRN A基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRNA基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2 mRN A基因表達互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異 (P＞0.05)。

造模后 7d:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRN A基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRNA基因表達升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2mRN A基因表達互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異 (P＞0.05)。

表1 脊髓組織中 Slit-2基因表達圖像分析結(jié)果(±SD)

表1 脊髓組織中 Slit-2基因表達圖像分析結(jié)果(±SD)

注:與模型組比較△ P＜0.05。

組 別 n 6h n 1d n 7d模型 組 6 0.410± 0.049 6 0.503± 0.031 6 0.617± 0.10空白 組 6 0.288±0.063△ 6 0.225±0.061 6 0.217±0.022△電針組 6 0.616±0.031△ 6 0.714± 0.102△ 6 0.813±0.114△藥物組 6 0.580±0.134△ 6 0.694± 0.112△ 6 0.745±0.059△

2.2 脊髓 Slit-2基因表達圖

圖中最左邊泳道為 maker,2～ 7泳道為 1d模型組,8～ 13泳道為 1d空白組,14～ 19泳道為 1d藥物組,20～ 25泳道為 1d電針組。從圖中可以看出,模型組條帶顏色較暗,表示其表達較少;電針組和藥物組條帶顏色較亮,表示其表達較多。

3 討 論 SCI屬中醫(yī)“截癱”、“痿癖”范疇。中醫(yī)學(xué)認為脊髓損傷雖在脊柱,主要損及督脈。督脈總督周身之陽經(jīng),有統(tǒng)攝元陽、振奮全身陽經(jīng)的功能,且督脈與任、沖、陽維脈皆有聯(lián)系,可調(diào)節(jié)全身氣血,在全身經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)中處于主導(dǎo)地位,與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所描述的脊髓作為中樞神經(jīng)的功能相類似。因此一旦損傷,則氣血瘀滯,累及手足三陽經(jīng),導(dǎo)致經(jīng)氣不利、經(jīng)絡(luò)不通 ,或者出現(xiàn)肢體麻木 ,不能活動,甚至因陽經(jīng)久病而損及陰經(jīng),最終出現(xiàn)陰陽俱虛?？傊?中醫(yī)學(xué)認為脊髓損傷后所產(chǎn)生的各種癥狀,乃因瘀阻督脈,樞機統(tǒng)帥失職 ,三陽經(jīng)氣血逆亂而致。其病因為“瘀血”,病機為“督脈樞機不利”。因此在治療上應(yīng)該疏通督脈以壯一身之陽氣,而氣能行血,氣壯則血活,血活則瘀去,瘀去則氣機調(diào)暢、絡(luò)活經(jīng)通。督脈電針調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣、疏通氣血,還是一種脈沖電場,具有針刺和電場雙重作用。大量臨床實踐及實驗證明[3-5],電針能促進 SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

Slit是近年來發(fā)現(xiàn)的重要神經(jīng)生長導(dǎo)向因子[6]。分子質(zhì)量170～ 190KD,它以濃度梯度指導(dǎo)生長錐靶向生長[7],通過排斥性軸突導(dǎo)向,促進軸突分支,并且在神經(jīng)發(fā)育過程中通過排斥作用引導(dǎo)神經(jīng)前體細胞遷移[8,9]。Slits的主要功能為:對軸突生長的排斥性導(dǎo)向作用;引導(dǎo)神經(jīng)細胞運動的導(dǎo)向作用;促進背根神經(jīng)節(jié)軸突的延伸和分枝;抑制化學(xué)趨向因子誘導(dǎo)的白細胞運動[10]。

哺乳動物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 3種亞型:Slit1,Slit2,Slit3[11,12],其中在指導(dǎo)脊髓抻經(jīng)投射方面。Slit2起主導(dǎo)作用[13]。 Tessier-Lavigne實驗室證明 Slit2可排斥某些運動神經(jīng)元的軸突,還可促進感覺神經(jīng)元軸突的延伸。通過原位雜交觀察到 Slit2 mRN A表達在發(fā)育期脊髓神經(jīng)管的腹側(cè)、背側(cè)中線結(jié)構(gòu)以及運動神經(jīng)元前體區(qū)域。Slit2作為關(guān)鍵蛋白指導(dǎo)神經(jīng)纖維的生長方向發(fā)揮重要作用[14]。

我們在實驗中觀察到,在正常成年大鼠(空白組)脊髓前角運動細胞中,slit2 mRN A表達較低 ,脊髓損傷后的 6h、1d和 7d slit2mRN A表達顯著升高,炎性細胞開始在損傷周圍浸潤.此時損傷位點上方前角運動神經(jīng)元中 slit2 mRN A的表達明顯增加,而電針組和藥物組 6h、1d和 7d slit2 mRN A表達明顯升高程度大于模型組。這提示,電針治療對大鼠脊髓損傷后 Slit-2 mRN A表達具有明顯的促進作用,可能對軸突的正確導(dǎo)向性生長發(fā)揮重要作用。

諸多神經(jīng)營養(yǎng)因子如 NGF,N T-3,bFGF,BDN F,GDNF等在 SCI后均有表達,但再生軸突都很短且往往不能和損傷遠端建立正確的聯(lián)系,而 Slit作為一種大分子蛋白質(zhì),其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性本身就已說明它在引導(dǎo)神經(jīng)生長方面的重要地位,本實驗觀察到督脈電針能促進大鼠脊髓損傷后 Slit2大量表達。督脈電針可能是通過提高 SCI后脊髓 Slit的表達,引導(dǎo)再生的軸突穿越脊髓損傷區(qū)并沿著正確的路徑投射到靶目標,實現(xiàn)和下位靶器官的精確聯(lián)系,從而促進 SCI后的修復(fù)。

SCI后的再生修復(fù)是一個非常復(fù)雜的過程,脊髓損傷的實驗與臨床研究已取得了新的進展,治療效果不斷提高。但電針刺激通過什么樣的信息傳導(dǎo)通路對 Slit2表達進行調(diào)控,以及電針治療 SCI,均有待于學(xué)者們進一步深入探索。

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