β-連環(huán)蛋白與細(xì)胞周期蛋白 D1在宮頸鱗癌中的表達(dá)及意義

史慧星,陳 云,游慶朋,楊 磊,袁 紅

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤,宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是多因素多階段演變的結(jié)果,多種癌基因及抑癌基因參與了癌變過程。今后的目標(biāo)是在力爭早期診斷的同時,在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上確定宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的始動環(huán)節(jié),采用針對性的靶向治療。Wnt信號傳導(dǎo)通路是一種對控制胚胎發(fā)育有重要作用、進(jìn)化上保守的信號傳導(dǎo)通路,其決定細(xì)胞的分化和增生。研究表明 Wnt信號傳導(dǎo)通路不恰當(dāng)?shù)募せ顓⑴c了多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wnt通路致癌的關(guān)鍵是 β-連環(huán)蛋白 (β-catenin)降解障礙致使胞質(zhì)內(nèi)游離的 β-catenin聚集并與 Tcf/lef結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核,激活下游靶基因細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclinD1)的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Wnt信號通路途徑的改變在大腸癌發(fā)生中的作用已較明確,在其他惡性腫瘤中的改變也顯示出重要意義,深入了解該途徑的特點及其在宮頸癌中的變化對于宮頸癌的早期診斷、預(yù)后判斷及靶向治療研究具有重要的意義。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測正常宮頸鱗狀上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 (cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1的表達(dá)情況,分析其表達(dá)率的變化,探討其在 Wnt信號通路中對宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 標(biāo)本來源于 2007年 4月—2008年 12月河北省邢臺市人民醫(yī)院及邢臺礦業(yè)集團總醫(yī)院病理科宮頸癌手術(shù)和活檢的存檔蠟塊?；颊咝g(shù)前均未行放療或化療。宮頸鱗狀細(xì)胞癌 42例 (宮頸癌組),按組織學(xué)分級:Ⅰ級 8例;Ⅱ級 22例;Ⅲ級 12例。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 10例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 32例?；颊吣挲g 31～68歲,平均 48.9歲。CIN 20例 (CIN組,其中 CINⅡ級 9例,CINⅢ級 11例)。同時取正常宮頸組織 8例作為正常對照組。

1.2 試驗材料 β-catenin鼠抗人單克隆抗體為 ZYMED公司產(chǎn)品。CyclinD1兔抗人多克隆抗體為 Labvision公司產(chǎn)品。羊抗鼠二步法通用型試劑盒。羊抗兔二步法通用型試劑盒。EDTA抗原修復(fù)液。封閉用正常山羊血清工作液。顯色底物:3,3-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)。以上試劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 (1)采用 β-catenin免疫組織化學(xué)染色:二甲苯脫蠟 10 min×2,梯度乙醇入水 (100%×1,90%×1,80%×1)各 10 min,PBS緩沖液 5 min×1,在 3%甲醇 -過氧化氫混合液室溫 15 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液 5 min×3,EDTA抗原修復(fù)液,微波爐高火 2.5 min,解凍檔 10 min,室溫冷卻 30 min,PBS緩沖液 5 min×3,10%山羊血清封閉,濕盒內(nèi)室溫 30 min,β-cat鼠抗人單克隆抗體 (工作液 1:100),濕盒內(nèi) 4℃過夜,PBS緩沖液 5 min×3,羊抗鼠二步法工作液濕盒內(nèi)室溫 30 min,PBS緩沖液 5 min×3,DAB顯色液,組織顯色后用自來水中止反應(yīng),Mayer氏蘇木精染液20 s,自來水沖洗,乙醇脫水 (80%×1、90%×1、100%×1)各 10 min,二甲苯透明,中性樹脂封片。 (2)cyclinD1免疫組織化學(xué)染色。方法同上,以 cyclinD1兔抗人多克隆抗體和羊抗鼠二步法工作液代替 β-cat鼠抗人單克隆抗體和羊抗鼠二步法工作液。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) β-catenin:正常表達(dá)定位于細(xì)胞膜,細(xì)胞膜上有均勻的棕黃色著色,而胞漿中無染色或僅有微弱著色。細(xì)胞膜染色明顯減弱或消失同時胞漿或細(xì)胞核著色則判定為異常表達(dá)。cyclinD1:CyclinD1染色后棕黃色顆粒位于細(xì)胞核為陽性,以陽性細(xì)胞計數(shù)。染色細(xì)胞 ＜5%為陰性 (-),≥5%陽性細(xì)胞為陽性 (+)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用 χ2檢驗,四格表確切概率法和 Spearman相關(guān)分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin在正常宮頸鱗組織、CIN及宮頸癌中的表達(dá)β-catenin在 8例正常宮頸鱗狀上皮組織中均未見異位表達(dá)(見圖1),在 CIN、宮頸鱗癌組織中的異位陽性表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.69,P＜0.05)。正常宮頸組織中 β-catenin主要在胞膜表達(dá),CIN和宮頸鱗癌中 β-catenin在胞膜表達(dá)明顯減弱或缺失,隨著病變的發(fā)展,β-catenin逐漸呈現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),而宮頸鱗癌中胞質(zhì)的表達(dá)進(jìn)一步增強,但本組未發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá) (圖 2～3)。β-catenin在宮頸鱗癌不同組織分級中異位表達(dá)率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.30,P＜0.01);CIN組因例數(shù)較少未再行不同分級間比較。宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 β-catenin異位陽性表達(dá)率與未轉(zhuǎn)移組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.00,P＞0.05,見表 1～2)。

2.2 cyclinD1在正常宮頸組織、CIN及宮頸鱗癌中的表達(dá)cyclinD1在正常宮頸上皮細(xì)胞中均未見陽性表達(dá),cyclinD1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核 (見圖 4～5)。cyclinD1在 CIN、宮頸鱗癌組陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=5.52,P＜0.05,見表 1)。在宮頸鱗癌各分級組織中 cyclinD1陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=5.52,P＜0.05);宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 cyclinD1的陽性表達(dá)率與未轉(zhuǎn)移組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.36,P＞0.05,表 1～2)。

表1 β-catenin、cyclinD1在正常對照組、CIN及宮頸鱗癌組織中的表達(dá)比較Table 1 The expression ofβ-catenin and cyclinD1 in squamous cervical carcinoma,cervical intraepithelial neoplasia

表2 β-catenin、cyclinD1在宮頸鱗癌中的表達(dá)與組織分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 2 Correlation between the expression ofβ-catenin and cyclinD1 and tumor differentiation and lymph node involvement in squamous cervical carcinoma

圖1 β-catenin在正常組織中的表達(dá) (×400)Figur e 1 Membranous immunostaining ofβ-catenin in normal squamous cervical epithelium

圖2 β-catenin在 CIN組織中的表達(dá) (×400)Figure 2 Abnormal expression ofβ -catenin in CIN

圖3 β-catenin在宮頸鱗癌組織中的表達(dá) (×400)Figur e 3 Ectopic cytoplasmic accumulation ofβ -catenin in squamouscervical carcinoma

2.3 宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1表達(dá)之間的關(guān)系

在宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1共陽性表達(dá)有 21例,共陰性表達(dá)有 10例,β-catenin的異常表達(dá)與 cyclinD1的陽性表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.885,P＜0.05,見表 3)。

表3 β-catenin與 cyclinD1在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Relationship between expression ofβ -catenin and cyclinD1 in squamous carcinoma of the uterine cervix

圖4 CyclinD1在 CIN組織中的表達(dá) (×400)Figure 4 Expression of cyclinD1 in CIN

圖5 CyclinD1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá) (×400)Figur e 5 Overexpression of cyclinD1 in squamous cervical carcinoma

3 討論

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二大常見惡性腫瘤,在發(fā)展中國家女性中其發(fā)病率居第一,據(jù)世界范圍內(nèi)的統(tǒng)計,每年大約有 50萬宮頸癌新發(fā)病例,占所有癌癥新發(fā)病例的 15%,因此研究多種腫瘤相關(guān)因子與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系尤為重要[1]。

惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移涉及癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的一系列復(fù)雜過程中細(xì)胞粘附是一個重要環(huán)節(jié)。βcatenin是一種多功能的胞漿蛋白,既能與 E-鈣粘素 (E-cadherin)組成復(fù)合體,又是 Wnt信號傳導(dǎo)通路的重要調(diào)控因子,參與細(xì)胞的生長分化、黏附、組織修復(fù)、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。正常情況下,β-catenin與 E-cadherin的胞漿部分形成 β-catenin/E-cadherin復(fù)合體,定位于細(xì)胞膜,維持上皮細(xì)胞的極性和完整性。在胞漿中 β-catenin的水平通過兩組蛋白質(zhì)的功能競爭來調(diào)節(jié):一組為破壞復(fù)合體,是由 GSK3、Axin及APC組成的一種較大的蛋白復(fù)合體,起破壞 β-catenin的作用,使其保持低水平,從而關(guān)閉 Wnt信號傳導(dǎo)通路;另一組為拮抗蛋白類,在對 Wnt信號反應(yīng)時被活化,起拮抗破壞復(fù)合體的作用,使 β-catenin的水平升高,開啟 Wnt信號傳導(dǎo)通路[2-3]。正常情況下,β-catenin在細(xì)胞內(nèi)保持低水平,Wnt信號傳導(dǎo)通路處于關(guān)閉狀態(tài)。cyclinD1是 Wnt信號傳導(dǎo)通路的下游靶基因之一[4]。當(dāng) Wnt/β-catenin途徑處于激活狀態(tài)時,β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)及胞核中累積,作用于 cyclinD1啟動子中 LEF-1結(jié)合位點而激活其轉(zhuǎn)錄,cyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclin dependent kinases,CDKs)結(jié)合并激活后者,誘導(dǎo)成人視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤易感基因 (Rb)產(chǎn)物的磷酸化。使 Rb與轉(zhuǎn)錄因子 E2F解離,游離的 E2F進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞完成由 G1期到 S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)入增殖階段[5]。目前已知人類多種惡性腫瘤中存在 Wnt/β-catenin通路激活。免疫組織化學(xué)研究已表明在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn) β-catenin和 cyclinD1的異常表達(dá)及高表達(dá)[6-10],但在 Wnt信號通路中,cyclinD1作為 β-catenin主要調(diào)節(jié)的靶基因,兩者在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性尚不明確,未見相關(guān)報道。本研究對 42例宮頸鱗癌進(jìn)行了 β-catenin和 cyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了研究,以進(jìn)一步觀察 Wnt信號通路在該腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

本研究結(jié)果顯示:β-catenin及 cyclinD1在宮頸鱗癌中的異位表達(dá)及過表達(dá)分別達(dá) 64.3%及 61.9%,與其他文獻(xiàn)報道相似[6-10]。相關(guān)分析顯示兩者存在正相關(guān),且隨著正常宮頸組織→CIN→鱗癌的轉(zhuǎn)化,β-catenin及 cyclinD1的異常表達(dá)呈遞增趨勢,說明 Wnt/β-catenin通路的激活與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。本結(jié)果還顯示了 β-catenin異位表達(dá)及 cyclinD1過表達(dá)與宮頸鱗癌的組織分級成正相關(guān),表明 β-catenin的異常表達(dá)可能與腫瘤的惡性行為和去分化有一定的關(guān)系,是腫瘤細(xì)胞獲得高增殖活性和侵襲性的原因之一。由于本組隨訪不全,未能做相關(guān)預(yù)后方面的統(tǒng)計分析。但有文獻(xiàn)顯示 βcatenin的異常表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后無關(guān)[10]。

但目前對 Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中異常激活的具體環(huán)節(jié)尚不完全清楚。β-catenin基因在宮頸癌中突變率并不高,有報道為 17%甚至更低[11-12],說明 β-catenin基因突變可能僅在少數(shù)宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中起作用。另有人研究發(fā)現(xiàn)APC啟動子甲基化在宮頸癌中是一個頻繁事件,可能參與了Wnt/β-catenin信號通路異常激活[13-14]。

綜上所述,β-catenin及 cyclinD1在宮頸鱗癌中的異位表達(dá)及過表達(dá)分別達(dá) 64.3%及 61.9%,且隨著正常宮頸組織→CIN→鱗癌的轉(zhuǎn)化,β-catenin及 cyclinD1的異常表達(dá)呈遞增趨勢,β-catenin異位表達(dá)及 cyclinD1陽性表達(dá)均與宮頸鱗癌分化相關(guān),隨著宮頸癌的組織分級增高,β-catenin異位陽性表達(dá)、cyclinD1陽性表達(dá)逐漸增強,但兩者均與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)。以上結(jié)果表明 Wnt信號通路可能在宮頸發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

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