應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對發(fā)酵全混合日糧中可培養(yǎng)乳酸菌的調(diào)查

王福金 西野直樹 王靖宇

(1.大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,大連 116044;2.國立岡山大學(xué)自然科學(xué)與技術(shù)研究生院分子生物學(xué)科,日本岡山700- 8530)

應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對發(fā)酵全混合日糧中可培養(yǎng)乳酸菌的調(diào)查

王福金1西野直樹2王靖宇1

(1.大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,大連 116044;2.國立岡山大學(xué)自然科學(xué)與技術(shù)研究生院分子生物學(xué)科,日本岡山700- 8530)

為了了解發(fā)酵全混合日糧(TM R silage)發(fā)酵過程中的乳酸菌的菌種變化,應(yīng)用MRS瓊脂培養(yǎng)基對新鮮啤酒糟和豆腐渣以及它們的發(fā)酵 TM R(貯存0、14和56 d)的乳酸菌進行培養(yǎng),所得的可培養(yǎng)乳酸菌應(yīng)用PCRDGGE進行篩選,對菌體DNA的堿基序列進行測定,在GenBank上檢索相近的16S rDNA序列對其鑒定。結(jié)果表明:2種原料中的乳酸菌種類完全不同;加入相同的其他材料變成TM R后,優(yōu)勢乳酸菌發(fā)生改變;發(fā)酵初期(14 d)的2種發(fā)酵TMR中都有2種乳酸菌,并且有1種乳酸菌相同;發(fā)酵后期(56 d)的2種發(fā)酵TM R中都有5種乳酸菌,而且有4種乳酸菌相同。由此可知,采用不同食品廢棄物所制作的發(fā)酵TMR,在發(fā)酵后期所含菌種趨于相同、種類增加。

PCR-DGGE;發(fā)酵 TM R;可培養(yǎng)乳酸菌;分離;鑒定

普通的發(fā)酵青貯料(silage)中,與飼料發(fā)酵有關(guān)的有乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)以及魏斯氏菌屬(Weissella)的乳酸菌[1-5]。這些乳酸菌在不同的發(fā)酵期,其優(yōu)勢菌也有所不同,在發(fā)酵初期以乳酸球菌為優(yōu)勢菌,但隨著發(fā)酵進程優(yōu)勢減弱,到后期由乳酸桿菌取代[6],而在發(fā)酵全混合日糧(TMR silage)中的乳酸菌種類、數(shù)量等問題卻知之甚少。2003年Nishino等[7]從發(fā)酵TMR中分離出布赫納乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)以來,陸續(xù)有干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、魏斯氏菌(Weissella spp.)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)等乳酸菌被發(fā)現(xiàn)[8-9],但在TMR發(fā)酵各時期的乳酸菌種的變化尚不清楚。因此,本試驗利用PCRDGGE技術(shù)對發(fā)酵TMR在發(fā)酵各時期的乳酸菌種類進行了分離,為尋找出提高發(fā)酵TMR好氣安定性的菌種,開發(fā)調(diào)制發(fā)酵TMR所使用的添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵TMR的調(diào)制與貯存

采用新鮮的啤酒糟或豆腐渣(占50%),配以干苜蓿草、干蘇丹草、玉米、麥麩、干甜菜渣、糖蜜和豆粕,調(diào)制成2種 TMR(表1)。將調(diào)好的TMR材料300 g,放入0.05mm厚的塑料袋(27mm×39mm)中真空密封,保存在 25℃恒溫室內(nèi),貯存 0、14和56 d。

1.2 乳酸菌的培養(yǎng)與分離

取新鮮的啤酒糟、豆腐渣、貯存0、14和56 d的2種發(fā)酵TMR各20 g,加入180 m L生理鹽水,震蕩10m in,在無菌狀態(tài)下,將溶菌液等比以10倍梯度逐級稀釋至10-7,再將各濃度的溶菌液在培養(yǎng)皿中與加熱融化的MRS瓊脂培養(yǎng)基充分混合,待瓊脂凝固后,移至30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

在每種樣本的固體培養(yǎng)皿中,挑選有20～30個菌落的培養(yǎng)皿任意釣取10個菌落接種于液體MRS瓊脂培養(yǎng)基中提純,培養(yǎng)3 d繼代1次,共繼代3次,菌液50μL與10%滅菌脫脂奶粉混勻,-21℃保存。

表1 2種TMR的成分、營養(yǎng)水平及微生物組成Tab le 1 Ingredients,nutrient levels and m icrobial compositions of tw o TMR

1.3 乳酸菌DNA的提取

將液體培養(yǎng)液在8 000 r/m in、4℃的條件下離心15 m in獲得菌體。應(yīng)用 DNeasy Tissue K it(QIAGEN,美國)試劑盒提取乳酸菌DNA,-21℃保存。

1.4 乳酸菌種類的篩選

提取的細菌DNA應(yīng)用PCR在16s rDNA的V 3 領(lǐng) 域增 幅,引 物 為 GC357 f(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 517r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′),采 用 30 次循環(huán)進行增幅(TP650,TaKaRa公司,日本),產(chǎn)物為160 bp。應(yīng)用 DGGE(DCode Universal M utation System Bio-red公司,日本)對PCR增幅產(chǎn)物進行電泳分離,濃度梯度為25%～50%,條件為150V、12 h 、60 ℃。

篩選標準:電泳后凝膠中條帶處于同一水平線上的為同一菌種,只取1個樣本備用,其余舍棄;對于不同水平線上的,全部留用,以備下一步DNA的鑒定。

1.5 乳酸菌的鑒定

將篩選后的細菌DNA應(yīng)用PCR的Bye Dye 25法,使其在全域增幅,引物為27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1 492r(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)處理后在ABIPRISMTM310Genetic Analyzer(ABIApp lied Biosystems,美國)進行堿基序列測定,所得結(jié)果在GenBank中進行檢索,確定細菌的種類和名稱(整個試驗過程見圖1)。

圖1 試驗的流程圖Fig.1 Schematic flow of the experiment

2 結(jié) 果

本次試驗所獲得的DGGE的DNA電泳條帶如圖2、圖3和圖4所示,圖中的DNA條帶通過堿基序列測定后,在GenBank中的檢索結(jié)果見表2。

2.1 新鮮啤酒糟和豆腐渣及其發(fā)酵TMR中的可培養(yǎng)乳酸菌

在新鮮的啤酒糟的10個樣本中檢出了發(fā)酵乳桿菌和副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)2種乳酸菌(圖2),其中后者為優(yōu)勢菌(表3)。加入其他材料混合成TMR后菌種發(fā)生了變化,10個樣本中副干酪乳桿菌未被檢出,而出現(xiàn)了德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii),并與發(fā)酵乳桿菌一起構(gòu)成優(yōu)勢菌。新鮮的啤酒糟與其發(fā)酵TMR中都有共有的一個菌種是發(fā)酵乳桿菌。

同樣,在新鮮豆腐渣10個樣本中檢出3種乳酸菌,胚芽乳桿菌、假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)和魏斯氏菌(圖2),其中前者為優(yōu)勢菌(表3)。加入其他材料后菌種發(fā)生變化,10個樣本中檢出胚芽乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和牛鏈球菌(Streptococcusbovis)3種乳酸菌,其中前兩者一起構(gòu)成優(yōu)勢菌(表3)。新鮮豆腐渣與其發(fā)酵 TMR中也有一共同菌種發(fā)酵乳桿菌,但和啤酒糟與其TMR中所含菌種不同。

2.2 貯存14 d的發(fā)酵TMR中的可培養(yǎng)乳酸菌

在所有發(fā)酵14 d的含有啤酒糟的發(fā)酵 TMR的30個樣本中,只有2種乳酸菌胚芽乳桿菌和短乳桿菌被檢出(圖3),其中前者為優(yōu)勢菌(表3)。

同樣,在發(fā)酵14 d的豆腐渣發(fā)酵TMR的30個樣本中,也只有假腸膜明串珠菌和胚芽乳桿菌2種乳酸菌被檢出見(圖3),其中前者數(shù)量多,為優(yōu)勢菌(表3)。

圖2 新鮮啤酒糟和豆腐渣以及其TMR中的乳酸菌DNA條帶Fig.2 DNA-bands of lac tic acid bacteria of fresh brewers grains,fresh soybean curd residues and their TMR

表2 堿基序列測定結(jié)果與在GenBank中檢索到的乳酸菌的相似率Table 2 Sim ilar rate of searched lac tic acid bac teria in GenBank and result of determ ination of base sequence

項目Items條帶Band相近菌種Sim ilar lactic acid bacteria species堿基數(shù)Number of bases相似率Sim ilar rate/%GenBank登記號Registration Num ber m 胚芽乳桿菌 Lactobacillus plantarum 546 97 EF185922.1 n 布赫納乳桿菌Lactobacillus buchneri 525 96 AB289212.1 o小片球菌 Pediococcus parvulus 425 98 DQ885528.1 p 乳酸片球菌Pediococcus acidilactici 508 94 AF404711.1 q短乳桿菌Lactobacillus brevis 577 98 AB266535.1 r圖4 Fig.4乳酸片球菌Pediococcus acidilactici 256 90 EF059987.1 s乳酸片球菌Pediococcus acidilactici 784 99 AF375914.1 t 乳酸片球菌Pediococcus acidilactici 299 95 EF059986.1 u副干酪乳桿菌Lactobacillus paracase i 546 85 AB289228.1副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei 871 73 DQ462440.1 w短乳桿菌Lactobacillus brevis 640 93 AY974809.1 v x 短乳桿菌Lactobacillus brevis 643 95 DQ268866.1 y胚芽乳桿菌 Lactobacillus plantarum 869 80 DQ480531.1 z 布赫納乳桿菌Lactobacillus buchneri 677 96 AB205056.1

表3 2種材料及其發(fā)酵TM R中的乳酸菌的種類Tab le 3 Lactic acid bacteria species of tw om aterials and their TMR by identification

圖3 貯存14 d的2種發(fā)酵TMR中的乳酸菌DNA條帶Fig.3 DNA bands of lactic acid bacteria of two TMR silages after ensiled for 14 days

圖4 貯存56 d的2種發(fā)酵TMR中的乳酸菌DNA條帶Fig.4 DNA bands of lactic acid bacteria of two TMR silages after ensiled for 56 days

同時2種發(fā)酵TMR中都有一共同的菌種胚芽乳桿菌。

2.3 貯存56 d的發(fā)酵TMR中的可培養(yǎng)乳酸菌

在發(fā)酵56 d的含啤酒糟發(fā)酵TMR的30個樣本中檢出5種乳酸菌(圖4),其中布赫納乳桿菌含量最多,乳酸片球菌和胚芽乳桿菌次之,小片球菌(Pediococcus parvu lus)和短乳桿菌最少(表3)。

而在發(fā)酵56 d的含豆腐渣發(fā)酵TMR的30個樣本中也檢出5種乳酸菌(圖4),其中短乳桿菌、乳酸片球菌和副干酪乳桿菌較多,胚芽乳桿菌和布赫納乳桿菌最少(表3)。

值得關(guān)注的是2種發(fā)酵 TMR之間,竟有布赫納乳桿菌、乳酸片球菌、胚芽乳桿菌和短乳桿菌 4種共同含有的乳酸菌;占所含菌量的96.5%(含啤酒糟發(fā)酵TMR)和70.0%(含豆腐渣發(fā)酵TMR)。

3 討 論

乳酸菌是一種過氧化氫酶陰性菌,通常情況下只能在厭氧條件下存活。但乳酸菌可以將部分的氧的毒性排出體外,當(dāng)與氧氣接觸時,不能像絕對厭氧菌那樣完全死亡[10]。因此,自然界存在著許多乳酸菌,由于有氧狀態(tài)限制了它們的繁殖,它們地域和附著物種的不同所存在的菌種也不同,本次試驗中的材料新鮮啤酒糟和豆腐渣中的優(yōu)勢乳酸菌的不同,也說明了這一點。當(dāng)2種新鮮材料與同樣的其他材料混合形成2種TMR時,優(yōu)先乳酸菌種也發(fā)生了變化,由于是有氧狀態(tài)乳酸菌不能大量繁殖,因此,結(jié)果表明是其他材料中所附著的乳酸菌造成的,2種TMR(貯存14 d)中共同含有1種乳酸菌發(fā)酵乳桿菌也說明了這一點。

內(nèi)田仙二[11]曾報道,發(fā)酵青貯飼料在厭氧發(fā)酵過程中,材料上所附著的乳酸菌的不同,不同乳酸菌所利用的糖及有機酸的基質(zhì)也不同,所產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸等生成物的比例也不同。從這次試驗結(jié)果來看,在貯存14 d的2種發(fā)酵TMR中各自檢出2種乳酸菌,而在貯存56 d的2種發(fā)酵TMR中各自檢出5種乳酸菌。因此,發(fā)酵 TMR中的乳酸菌的變化,不是簡單的材料上附著的優(yōu)勢菌的擴繁,而是同一乳酸菌種間優(yōu)勢競爭的、此消彼長的動態(tài)平衡狀態(tài)。

從以前的試驗結(jié)果來看,發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量是低(貯存0 d)、高(貯存初期)、低(貯存后期)的變化規(guī)律[9,12-15],結(jié)合本次試驗結(jié)果,貯存初期(14 d)乳酸菌數(shù)量大,但菌種類少;而貯存后期(56 d)時數(shù)量上有所減少,但菌種數(shù)量增加。說明在發(fā)酵TMR的發(fā)酵初期,一些適應(yīng)這一環(huán)境的乳酸菌迅速繁殖,數(shù)量上增加,但到發(fā)酵后期環(huán)境(pH、養(yǎng)分等)的變化,它們的繁殖也受到了限制,數(shù)量有所減少,而其他乳酸菌量得以擴充,達到多種乳酸菌共同處于優(yōu)勢的狀態(tài)。但2種發(fā)酵TMR中的乳酸菌種趨于相同,這為發(fā)酵TMR菌種添加劑的研制提供了可靠的依據(jù)。

本試驗是在發(fā)酵TMR開封后有氧狀態(tài)下進行的,有可能忽略了一些對氧敏感的乳酸菌;另外對1個樣本的培養(yǎng)皿中只釣取10個菌落進行鑒定,有可能漏掉一些已培養(yǎng)的乳酸菌,因此在今后的試驗方法上還需要進一步改進與探討。

4 結(jié) 論

采用50%的新鮮啤酒糟和50%的新鮮豆腐渣,再配以相同的其他材料所制成的2種發(fā)酵TMR,在發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時間的延長,所含乳酸菌的種類逐漸增多,而且乳酸菌菌種有趨于相同的趨勢。

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Au thor,WANG Fujin,associate professor,E-mail:w angfujin2000@qq.com

(編輯 王智航)

Investigation of Cultivab le Lactic Acid Bacteria in TotalMixed Ration Silages by PCR-DGGE Technique

WANG Fujin1NISHINO Naoki2WANG Jingyu1

(1.Laboratory Animal Center,Dalian Medical University,Dalian116044,China;2.Depar tment of Biomolecular Science,Graduate School of Natural Science and Technology,Okayama University,Okayama700-8530,Japan)

To understand the change of lactic acid bacteria during totalm ixed ration(TM R)silages ensiled process,M RSagar was used to cultivate and separate lac tic acid bacteria from fresh brew ers grains,soybean curd residue and their TMR silages(stored for 0 day,14 and 56 days);These cultivab le lactic ac id bacteria were screened by PCR-DGGE,and then the p roducts were analyzed for bac terial DNA sequences.GenBank database w as searched to determ ine the closest relatives of 16S rDNA sequences to identity them.The results show ed that the lactic acid bacteria were dif ferent between fresh brew ers grains and soybean curd residue;and the p redom inant lactic ac id bacteria species were altered w hen they were m ixed with other materials.There were two species of lac tic acid bac teria in both of the tw o TMR silages in the initial period of fermentation,and one species was the sam e between the tw o TMR silages;but five species of lactic acid bacteriawere found in the two TMR silages in later fermen tation,and four specieswere the sam e between the two TMR silages.In conclusion,lactic acid bacteria species tend to be the sam e,and species types increase in later fermentation w hen using different food by-products to make TM R silages.[Chinese Journal of Anima l Nutrition,2010,22(6):1636-1643]

PCR-DGGE;TM R silage;cultivable lactic bacteria;separation;Identification

S816.3 S816.6

A

1006-267X(2010)06-1636-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.025

2010-04-20

王福金(1964—),男,吉林通榆人,副教授,博士,主要從事動物營養(yǎng)研究。E-mail:wangfujin2000@qq.com