不同酪蛋白添加水平對湖羊腸系膜排流組織、門靜脈排流組織中游離氨基酸和肽結(jié)合氨基酸凈流量的影響

孫龍生 王春梅,2 趙國琦* 吳 敏 王雅倩栗文鈺

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚州 225009;2.徐州生物工程高等職業(yè)學(xué)校,徐州 221006）

對反芻動物來說,肽吸收具有重要的生理意義。反芻動物對肽和氨基酸的吸收存在2種途徑,即腸系膜系統(tǒng)和非腸系膜系統(tǒng),且非腸系膜系統(tǒng)是反芻動物肽吸收的主要途徑,其中瘤胃和瓣胃是肽吸收的主要部位[1]。但也有研究認(rèn)為,小腸吸收的肽可能是門靜脈排流組織（portal-d rained viscera, PDV）中肽的主要來源[2]。一般認(rèn)為,二肽、三肽被吸收攝入腸細(xì)胞后,再被腸細(xì)胞中的肽酶水解,主要以游離氨基酸（free am ino acid,FAA）的形式進(jìn)入血液循環(huán)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)中肽量的變化與底物中某些肽的完整吸收有關(guān),蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的一些肽可以被動物完整吸收[3]。樂國偉等[4]也證實,動物的消化道能以完整形式吸收肽進(jìn)入血液循環(huán),腸壁具有利用FAA合成肽的能力。多數(shù)研究者提出,循環(huán)中肽的重要來源可能是食物中的肽。目前,人們重點研究了反芻動物瘤胃內(nèi)小肽吸收的情況[5-6]。王玲等[7]通過從十二指腸直接灌注大豆小肽,研究其對小腸中肽的吸收與利用的影響,認(rèn)為小腸中肽含量的增加可以促進(jìn)其在小腸的吸收。有關(guān)飼糧蛋白質(zhì)在反芻動物體內(nèi)的代謝過程與利用規(guī)律一直是研究的重點[8],特別是有關(guān)湖羊血漿中FAA和肽結(jié)合氨基酸（peptide-bound am ino acid, PAA）釋放量與飼糧蛋白質(zhì)水平之間的關(guān)系,目前尚未見報道。本試驗主要研究飼糧中不同酪蛋白添加水平對湖羊血漿中FAA和PAA的釋放量以及腸系膜排流組織（mesenteric-d rained viscera, MDV）和PDV中FAA與PAA凈流量的影響,為小肽營養(yǎng)理論提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選取3只體況良好的成年空懷母湖羊,體重（35±3）kg,安裝腸系膜靜脈插管（共2根,分別用于灌注和采血）、門靜脈插管和頸動脈插管。

1.2 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1,按粗精比7∶3配制。A組飼喂基礎(chǔ)飼糧,較高水平的蛋白質(zhì)飼糧由酪蛋白調(diào)節(jié)（食用級干酪素,粗蛋白質(zhì)92.03%）,酪蛋白添加量分別為3.0%（B組）、6.0%（C組）、9.0%（D組）。4組飼糧蛋白質(zhì)水平分別為8.4%、11.2%、14.0%、16.8%。試驗羊單籠飼養(yǎng),按體重的2.5%給料（干物質(zhì)）,于每日08:00和18:00 2次等量飼喂,自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab le 1 Com position and nutrient levels of basal diet （air-dry basis）%

1.3 試驗設(shè)計

4種不同蛋白質(zhì)水平飼糧和3只湖羊按4×3不完全拉丁方設(shè)計進(jìn)行試驗,試驗共分4期,每期分別飼喂不同飼糧。試驗預(yù)試期12 d,采樣期1 d。

1.4 試驗方案

從第13天早晨06:00開始向腸系膜靜脈持續(xù)灌注對氨基-馬尿酸（p-amino hippuric acid, PAH）配制液。PAH的配制參考Huntington等[9]的方法進(jìn)行,即用滅菌生理鹽水將PAH配制成15 mg/m L的工作液,并用NaOH或HC l調(diào)pH至7.0。灌注時,先灌注15 m L基本劑量的PAH,然后以PAH 12 mg/min（即0.8 m L/m in）的流速由腸系膜靜脈持續(xù)灌注7 h。PAH灌注2 h后每隔1 h分別同時從每只羊的門靜脈、腸系膜靜脈（另1根）、頸動脈血管中各采血2 m L,連續(xù)采5次,用于PAH的測定。在08:00（喂前）、10:00、12:00、14:00、16:00同時采集門靜脈、腸系膜靜脈和頸動脈血液,各取8m L血樣于肝素化的試管中,搖勻, 30 m in內(nèi)于4℃以5 000×g離心15 min。上清液置于-20℃保存待測。

1.5 樣品的處理與分析

1.5.1 樣品預(yù)處理

取2 m L血漿加入2 m L 10%三氯乙酸, 2 000×g離心20 m in,除去血漿中的蛋白質(zhì)。

1.5.2 FAA的測定

參照Rubio[10]介紹的方法。將去蛋白質(zhì)的血漿過0.22μm濾膜。取100μL濾液真空干燥后加入50μL干燥劑（甲醇∶水∶三乙胺=2∶1∶1）,真空干燥后,再加入50μL衍生劑（甲醇∶水∶三乙胺∶異硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶1）,衍生15m in,再次真空干燥,然后加入0.5 m L稀釋劑（10%磷酸∶乙腈=95∶5）稀釋,超聲波震蕩溶解后上機(jī)測定。

1.5.3 總氨基酸的測定

取過濾膜的無蛋白質(zhì)血漿2 m L,加入濃鹽酸2m L于水解管中,抽真空后110℃水解23 h,冷卻后定容至10 m L,取部分濾液過0.22μm濾膜。其他處理方法同F(xiàn)AA的測定。

1.5.4 PAA的計算

PAA的測算公式:樣品PAA含量=樣品酸解后總氨基酸含量-樣品酸解前總FAA含量

1.5.5 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18分析柱（4.6 mm× 250mm,5μm）,柱箱溫度:46℃,紫外檢測器波長: 254 nm。

1.5.6 PAH的分析測定

參照甄玉國等[11]介紹的方法。

1.5.7 門靜脈和腸系膜靜脈血漿流速、MDV和PDV中FAA或PAA流量的測定與計算

參照王崗[12]和Backwell等[13]介紹的方法:

1）門靜脈和腸系膜靜脈血漿流速

式中:I為腸系膜靜脈PAH灌注速度（m g/m in）,c（PAHPV）、c（PAHMV）、c（PAHA）分別為PAH在門靜脈、腸系膜靜脈和頸動脈血漿中的濃度（m g/L）,FPV、FMV分別為門靜脈、腸系膜靜脈的血漿流速（L/m in）。

2）MDV和PDV中FAA或PAA的流量

式中:c（M）、c（P）、c（A）分別為FAA或PAA在腸系膜靜脈、門靜脈和頸動脈血漿中的濃度（mg/L）,FMV、FPV分別為FAA或PAA在腸系膜靜脈和門靜脈的血漿流速（L/m in）,1.44為血氧飽和度。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel整理,運用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件GLM模塊進(jìn)行顯著性檢驗,多重比較采用Duncan氏法。試驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉχ±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧酪蛋白添加水平對血漿FAA和PAA濃度的影響

不同蛋白質(zhì)水平飼糧下湖羊血漿FAA、PAA濃度的測定結(jié)果見表2。由表2可知,4種蛋白質(zhì)水平飼糧下,腸系膜靜脈血漿中,D組FAA濃度最高,A組最低,D組顯著高于A組（P＜0.05）。血漿中PAA濃度較FAA濃度的2倍還高,說明在反芻動物消化道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收中,以肽形式吸收入血液的比例很高。組間比較表明,血漿中PAA濃度A組最低,C、D組顯著高于A組（P＜0.05）。

門靜脈血漿中,FAA濃度以D組最高,A組最低,D組顯著高于A組（P＜0.05）。組間PAA濃度比較結(jié)果顯示,C、D組顯著高于A組（P＜0.05）。

頸動脈血漿中,不同處理FAA濃度差異不顯著（P＞0.05）。PAA的濃度隨著蛋白質(zhì)水平的升高而升高,且D組顯著高于A組（P＜0.05）。

表2 飼糧酪蛋白添加水平對湖羊血漿FAA、PAA濃度的影響Table 2 Effects of dietary casein supplemen tal levels on concen trations of FAA and PAA in plasm a of Hu sheep mg/100 m L

2.2 飼糧酪蛋白添加水平對湖羊MDV、PDV中FAA和PAA凈流量的影響

湖羊門靜脈、腸系膜靜脈血漿流速及MDV、PDV中FAA和PAA凈流量的測定結(jié)果見表3。由表3可知,隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高,湖羊腸系膜靜脈和門靜脈血漿流速顯著增加。腸系膜靜脈中, C、D組血漿流速較高,A組最低,C、D組極顯著高于A組（P＜0.01）,B組顯著高于A組（P＜0.05）。門靜脈血漿流速也是以C、D組較高,A組最低,C、D組顯著高于A組（P＜0.05）。

由表3可見,飼糧蛋白質(zhì)水平對湖羊MDV和 PDV中FAA和PAA凈流量有顯著影響。隨飼糧酪蛋白添加水平增加,從腸系膜系統(tǒng)中吸收的FAA相應(yīng)增加,D組極顯著高于A組（P＜0.01）,顯著高于B組（P＜0.05）,C組顯著高于A組（P＜0.05）;以肽形式吸收的氨基酸以C組最高,并顯著高于A、B組（P＜0.05）,C組與D組間差異不顯著（P＞0.05）。PDV中FAA凈流量以C組最高,極顯著高于A組（P＜0.01）,與B、D組差異顯著（P＜0.05）。PDV中存在明顯的PAA凈流量,C、D組極顯著高于A組（P＜0.01）,顯著高于B組（P＜0.05）。

表3 飼糧酪蛋白添加水平對湖羊門靜脈、腸系膜靜脈血漿流速及MDV、PDV中FAA和PAA凈流量的影響Table 3 Effects o f dietary casein supplemental levels on plasm a flows in portal andm esenteric vein as well as the net flux of FAA and PAA in MDV and PDV of Hu sheep

3 討 論

3.1 飼糧蛋白質(zhì)水平對湖羊血漿FAA、PAA濃度及血漿流速的影響

在動物體內(nèi),小肽與FAA 2種吸收機(jī)制對氨基酸吸收的貢獻(xiàn)大小,取決于胃腸道蛋白質(zhì)消化過程中釋放的肽與FAA的數(shù)量及比例[14]。在反芻動物營養(yǎng)中,血漿FAA的探討對湖羊氨基酸營養(yǎng)需要和利用的研究具有重要作用。本試驗中,在一定范圍內(nèi),隨飼糧酪蛋白添加水平的提高,腸系膜靜脈和門靜脈血漿中FAA濃度顯著增加,但飼糧蛋白質(zhì)水平較高時,血漿FAA濃度增加趨緩,這是動物機(jī)體通過對氨基酸代謝的調(diào)節(jié),以保持血液內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。Y ang等[15]認(rèn)為,一般情況下,反芻動物血漿FAA保持恒定,只有當(dāng)飼糧中氨基酸水平超過動物最大生長需要時,血漿FAA水平才會增加。也有認(rèn)為,高的血漿FAA水平或許是由于飼糧蛋白質(zhì)過量或體蛋白質(zhì)的大量分解所致。本試驗結(jié)果表明,隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的提高,腸系膜靜脈和門靜脈PAA濃度呈增加趨勢,并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAA濃度。這不僅表明湖羊血漿PAA濃度與飼糧蛋白質(zhì)水平密切相關(guān),同時也提示PAA可能是反芻動物消化道吸收的主要方式。Zhang等[16]比較了大豆小肽與FAA對山羊的利用情況,結(jié)果表明,大豆小肽在改善氮平衡狀況、提高蛋白質(zhì)生物學(xué)價值及養(yǎng)分的消化率等方面均優(yōu)于FAA。本試驗中,無論是腸系膜靜脈還是門靜脈,其總氨基酸中PAA所占比例比相關(guān)報道要高[17],可能與試驗所選蛋白質(zhì)種類不同有關(guān)。

血漿流速能反映動物的代謝狀況,飼糧營養(yǎng)水平往往影響動物的代謝水平與強(qiáng)度。本試驗結(jié)果表明,湖羊腸系膜靜脈和門靜脈血漿流速隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高而顯著增加。這就解釋了飼糧蛋白質(zhì)水平較高時,血漿氨基酸水平能保持相對恒定的現(xiàn)象。王玲等[7]在比較經(jīng)十二指腸灌注大豆小肽和FAA時發(fā)現(xiàn),大豆小肽有提高腸系膜靜脈和門靜脈血漿流量的趨勢。甄玉國等[11]的研究結(jié)果表明,小腸可吸收氨基酸模式對絨山羊血液流速沒有影響。這進(jìn)一步表明,動物機(jī)體代謝強(qiáng)度與飼糧營養(yǎng)水平特別是蛋白質(zhì)水平間存在動態(tài)調(diào)節(jié)與平衡機(jī)制。

3.2 飼糧蛋白質(zhì)水平對湖羊MDV、PDV中FAA和PAA凈流量的影響

反芻動物MDV、PDV中FAA和PAA的凈流量能夠反映飼料蛋白質(zhì)經(jīng)消化道消化后其FAA與小肽的吸收與分布情況。王崗[13]研究發(fā)現(xiàn),從腸系膜系統(tǒng)中吸收的FAA較多,而從非腸系膜系統(tǒng)吸收的PAA較多,表明非腸系膜系統(tǒng)是反芻動物肽吸收的主要途徑。王玲等[17]研究了經(jīng)十二指腸灌注不同水平大豆小肽后,奶山羊MDV總FAA和PAA的凈流量,結(jié)果表明,2種凈吸收進(jìn)入腸系膜靜脈的氨基酸流量均隨大豆小肽灌注水平的提高而顯著提高,進(jìn)一步證實了小腸是機(jī)體小肽吸收的另一貢獻(xiàn)者。本試驗得到了類似的結(jié)果,飼糧蛋白質(zhì)水平對MDV和PDV中PAA凈流量有顯著影響,并且隨飼糧蛋白質(zhì)水平升高,湖羊PDV和MDV中FAA和PAA凈流量顯著增加,特別是PDV存在明顯的PAA凈流量。當(dāng)飼糧蛋白質(zhì)達(dá)到較高水平時,PDV和MDV中PAA凈流量并不隨飼糧蛋白質(zhì)水平的增加而增大,原因可能與動物為保持血液內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)衡而進(jìn)行的代謝性調(diào)節(jié)有關(guān),也可能與飼糧酪蛋白的添加水平過高有關(guān)。李海燕等[5]研究了瘤胃灌注不同水平酪蛋白后瘤胃蛋白質(zhì)代謝的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),60 g/d灌注的羊其瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量并不比50 g/d灌注的羊高。Seal等[18]在閹牛、綿羊和大鼠門靜脈內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)肽的凈流量。Seal等[19]研究后認(rèn)為,小肽基本上不影響反芻動物門靜脈的血氨濃度。Backwell等[13]研究也發(fā)現(xiàn),連續(xù)飼喂條件下,綿羊動脈、門靜脈和腸系膜血液中肽的濃度非常接近,消化道對肽沒有明顯的凈吸收利用。實際上,影響動物對蛋白質(zhì)消化、吸收的因素,如飼糧蛋白質(zhì)水平與品質(zhì)、不同蛋白質(zhì)飼料與投喂方式、肽的氨基酸組成與結(jié)構(gòu)等,都會對肽的凈流量產(chǎn)生影響。由于反芻動物肽吸收的主要器官是瘤胃和瓣胃,即非腸系膜系統(tǒng),MDV肽的吸收只是其有益補(bǔ)充,所以,就MDV和PDV中PAA和FAA凈流量而言,小腸中肽濃度的增加對MDV的影響大于對PDV的影響。本試驗初步探討了飼糧蛋白質(zhì)水平與湖羊體內(nèi)肽和氨基酸吸收周轉(zhuǎn)情況的關(guān)系,在小肽種類及吸收機(jī)制與效率方面還需做深入研究。

4 小 結(jié)

①湖羊腸系膜靜脈和門靜脈血漿中FAA和PAA濃度隨飼糧蛋白質(zhì)水平的增加而升高,并且PAA濃度高于FAA濃度,表明在反芻動物蛋白質(zhì)吸收中,以小肽形式的吸收占有重要地位。

②飼糧蛋白質(zhì)水平對MDV和PDV中FAA和PAA凈流量有顯著影響。較高的蛋白質(zhì)水平飼糧下,MDV和PDV中FAA和PAA凈流量也較高,特別是PDV中存在明顯的PAA凈流量。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:jszhaoguoqi@hotmail.com

（編輯 尚彬如）