蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

熊 偉

（1 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,云南大理 671000）

目前，隨著人類全基因組序列草圖的完成，人類已經(jīng)由基因組計(jì)劃進(jìn)入后基因組時代，而且許多模式生物的基因組測序也已基本完成?；蚪M時代的研究發(fā)現(xiàn)，基因是遺傳信息的攜帶者，但基因數(shù)量的有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性，與生命現(xiàn)象的復(fù)雜性與多變性之間存在著巨大的反差。人們逐漸意識到，要研究生命現(xiàn)象，僅僅研究基因組的結(jié)構(gòu)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，必須對生命活動的直接執(zhí)行者-蛋白質(zhì)的重要性有更深刻的了解。因此，蛋白質(zhì)組的概念應(yīng)運(yùn)而生，指由在特定的生理和病理?xiàng)l件下一個基因組、或一個細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）即以蛋白質(zhì)組為研究對象的研究領(lǐng)域，從蛋白質(zhì)的水平進(jìn)一步認(rèn)識生命活動的機(jī)理和疾病發(fā)生的分子機(jī)制。蛋白質(zhì)組研究是對基因組研究的重要補(bǔ)充，它是對生物體在蛋白質(zhì)水平定量、動態(tài)、整體性的研究。從組織或者細(xì)胞的整體入手研究基因編碼與翻譯的蛋白質(zhì)（功能蛋白質(zhì)組）將是未來很長一段時間里蛋白質(zhì)組研究的熱點(diǎn)問題。

作為研究蛋白質(zhì)組的三大核心技術(shù)之一（另外兩種分別是計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)），雙向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）是目前唯一可將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離的方法，雙向電泳技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)被國際公認(rèn)是目前蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究、蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞分化凋亡研究、致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究、療效監(jiān)測、新藥開發(fā)、癌癥研究、蛋白純度檢查、小量蛋白純化、新替代疫苗的研制等許多方面。本文僅就雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)、人類腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)以及藥物作用機(jī)制研究中所取得的一些進(jìn)展做一綜述。

1. 雙向電泳技術(shù)

1.1 雙向電泳技術(shù)的研究歷史

1975年O’Farrell對大腸桿菌、老鼠及幾尼豬蛋白質(zhì)的研究中，首先建立了經(jīng)典的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系。他用管狀載體兩性電解質(zhì)凝膠作為第一向進(jìn)行等電聚焦，聚焦后的管狀凝膠在含SDS的緩沖液中平衡后，以瓊脂糖包埋置于垂直板SDS凝膠的濃縮膠上，然后用Laemmli的不連續(xù)SDS梯度凝膠電泳作為第二向。這種雙向電泳技術(shù)被稱之為ISO - DALT系統(tǒng)。ISO - DALT系統(tǒng)存在著許多問題,如易發(fā)生陰極漂移，載體兩性電解質(zhì)pH梯度不穩(wěn)定以及重復(fù)性差等。為提高第一向聚焦的質(zhì)量，1985年Gorg A等發(fā)展了IPG - DALT系統(tǒng)雙向電泳技術(shù)。它利用固相pH介質(zhì)來形成一定范圍的pH梯度。固相pH介質(zhì)是一類丙烯酰胺的化合物,它與聚丙烯酰胺共價(jià)結(jié)合后形成一定范圍的pH梯度。它不受脫水、重新水化和電場等因素的影響，因而具有不產(chǎn)生陰極漂移, pH梯度穩(wěn)定，上樣量大，重復(fù)性好，分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。

因此，根據(jù)雙向電泳中第1 向等電聚焦方法的不同, 雙向電泳主要分為2 個主要類型, ISO-DALT( 等電點(diǎn)-道爾頓)和IPG-DALT(固相pH梯度-道爾頓)雙向電泳[2]。目前世界上大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室都選擇IPG -DALT系統(tǒng)雙向電泳技術(shù)。

1.2 雙向電泳技術(shù)的原理

雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一。它利用了各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的不同來分離復(fù)雜蛋白質(zhì)組分，具有較高的分辨率和靈敏度，目前已成為復(fù)雜蛋白質(zhì)組分檢測和分析的最好的生化技術(shù)。IPG - DALT系統(tǒng)雙向電泳技術(shù)原理簡明：首先利用等電聚焦( isoelectric focusing ,IEF)將蛋白質(zhì)沿pH 梯度分離至各自等電點(diǎn)(isoelectric point ,pI)，通過電荷分離蛋白質(zhì)；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通過分子量分離蛋白質(zhì)。所得蛋白雙維排列圖中每個點(diǎn)代表樣本中一個或數(shù)個蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和在樣本中的含量也可顯現(xiàn)出來[3]。蛋白雙向電泳的分辨率和靈敏度很高，一般可分離1000～3000 個蛋白質(zhì),最高可分辨11000 個蛋白質(zhì)，pI 差別小于0.003 個pH 單位也可以被分辨。目前在國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫如SWISSPROT和PIR中有大量的標(biāo)準(zhǔn)IPG-DALT 雙向電泳圖譜可供查閱。

2 雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組研究中的進(jìn)展

雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用,可用于研究樣品總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達(dá)差異、蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)修飾等。病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以了解其毒性因子、致病機(jī)理以及藥物抗性等方面，對疾病的診斷、治療和預(yù)防非常重要。

2.1 雙向電泳技術(shù)在病原微生物致病機(jī)理研究中的應(yīng)用

結(jié)核分枝桿菌是病原微生物研究的一個重點(diǎn)，Jungblut等[4]利用雙向電泳技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌H，Rv和作為疫苗的BCG菌株的比較蛋白質(zhì)組分析，有毒和無毒的菌種之間存在25種重要蛋白質(zhì)的差異，包括rplL和IJeuA編碼的持家蛋白質(zhì)、潛在致病性因子和一些假想蛋白質(zhì)；通過雙向電泳技術(shù)分析對培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)生長的細(xì)菌進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)感染巨噬細(xì)胞的軍團(tuán)菌、布魯氏菌、沙門氏菌中分別有一些特殊蛋白被誘導(dǎo)或被阻遏。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)可作為致病微生物臨床隔離群區(qū)分的可靠參數(shù)之一。Jungblut等[5]對4個幽門螺桿菌臨床隔離群的比較蛋白表達(dá)圖譜研究發(fā)現(xiàn)，按地區(qū)來源可以明顯分成兩組。對29株李斯特菌屬(Listeria)分離株的蛋白質(zhì)組研究可歸為6個亞類，其中19株產(chǎn)單核細(xì)胞李氏菌分為2個簇，這些與其他方法所得結(jié)果一致。在對流感嗜血桿菌研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的和臨床分離的遺傳背景相同的菌株出現(xiàn)了新的ORF，對臨床分離株NCTC8143進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)色氨酸酶的含量較高，而實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的菌株中則沒有色氨酸酶。

2.2 雙向電泳技術(shù)在病原微生物藥物抗性基因功能研究中的應(yīng)用

雙向電泳技術(shù)可以進(jìn)行微生物抗性機(jī)理的研究,Diffes等[6]對Divercin V41抗性和野生型的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌進(jìn)行2-DE分析，發(fā)現(xiàn)至少在17個蛋白質(zhì)存在差異，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9個蛋白質(zhì)，而新增8個蛋白質(zhì)，其中只有1個RI是存在于已知該菌的數(shù)據(jù)庫中，為鞭毛蛋白；機(jī)會致病真菌如念珠菌屬產(chǎn)生了許多的耐藥菌株。最近研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑類化合物通過抑制真菌細(xì)胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且對耐真菌藥物的菌株起作用。Bruneau等[7]對比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3種殺真菌藥處理所產(chǎn)生的白色念珠菌雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜后認(rèn)為，氟康唑和伊曲康唑在蛋白質(zhì)組水平具有共同的作用機(jī)制。Kahng等[8]對不動桿菌的碳源分解代謝進(jìn)行研究，生長在琥珀酸鹽或p-hydroxybenzoate培養(yǎng)基不動桿菌屬的A.1wofii K24(可以分解磺胺藥物前體aniline)，對比它們經(jīng)柱分離后的雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜，用N端測序和內(nèi)部測序(ESI.MS／MS)鑒別了差別表達(dá)的兩種原兒茶酸_3，4.二加氧酶亞基pcaH和pcaG，它們都與p-hydroxybenzoate的分解代謝有關(guān)，可能是該菌株耐藥性產(chǎn)生的主要原因。因此，病原微生物的耐藥菌株和敏感菌株的雙向電泳研究，對闡明耐藥相關(guān)機(jī)制、鑒定新的藥物靶位和耐藥診斷標(biāo)志有非常重要的價(jià)值。

3 雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展

人們通過雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展。

腫瘤發(fā)生的早期常常無任何癥狀,而只有在轉(zhuǎn)移時才容易被發(fā)現(xiàn),這往往導(dǎo)致延誤了治療的最佳時期。因此找到腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行及時的診斷和治療顯得尤為重要。Wadsworth J T等[9]篩選了99例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者和102例正常對照的血清蛋白質(zhì)表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)了幾種蛋白在患者與健康人中不同的表達(dá)情況，這種血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜經(jīng)處理分析，確定檢測到的幾種蛋白質(zhì)作為早期標(biāo)志物可以篩選頭頸部腫瘤,靈敏度及特異性分別達(dá)83. 3 %與100 % 。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，居所有惡性腫瘤的第八位，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。Kageyama等[10]通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)calreticulin(CRT)在膀胱癌組織中高表達(dá),定量Western blotting技術(shù)比較22例膀胱癌和10例正常膀胱上皮組織也發(fā)現(xiàn)calreticulin(CRT)在膀胱癌組織中高達(dá),Western blotting分析70例膀胱癌病人發(fā)現(xiàn)尿樣中檢測CRT的特異性為86%。這表明CRT有可能作為臨床上檢測膀胱癌的診斷標(biāo)志物。

通過雙向電泳技術(shù)可以從整體出發(fā)在分子水平上研究惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制。Alaiya等[11]利用雙向電泳技術(shù)研究了前列腺增生及前列腺癌的多肽圖譜,發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、calreticulin、HSP90等9種蛋白的表達(dá)水平在惡性腫瘤中明顯增加,而原肌球蛋白- 1,2 和cytokeration 18的表達(dá)水平卻明顯下降。這種變化模式與他們以前研究的多種惡性腫瘤相似，很可能為研究惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理提供幫助。熊興東等[12]應(yīng)用雙向電泳技術(shù)比較了人胚永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE和由SHEE轉(zhuǎn)化而來的食管癌細(xì)胞系SHEEC 的差異表達(dá)核基質(zhì)蛋白(NMPs),并利用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALD I - TOF - MS)鑒定出了3個差異表達(dá)核基質(zhì)蛋白。這些食管癌差異表達(dá)NMPs可能在SHEE 惡性病變?yōu)镾HEEC的過程中發(fā)揮重要的作用，它們的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究食管癌的發(fā)病機(jī)制提供了很好的基礎(chǔ)材料。另外，Hewett[13]結(jié)合高分辨率的雙向電泳技術(shù)和高靈敏度的化學(xué)發(fā)光技術(shù)比較了經(jīng)sulpho - NHS - 生物素標(biāo)記的內(nèi)皮膜蛋白,發(fā)現(xiàn)有六種蛋白的表達(dá)水平在幾種不同的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(乳腺癌、肺癌)中都發(fā)生相同的改變,而這六種蛋白在不同血管床起源的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中都是上調(diào)的。這暗示腫瘤血管介導(dǎo)的內(nèi)皮靶標(biāo)在新的腫瘤治療方式開發(fā)研究中前景廣闊。

4 雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展

雙向電泳技術(shù)的出現(xiàn),為動態(tài)、高通量的研究藥物作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的方法支持。閆雪冬等[14]利用卵巢上皮性癌(卵巢癌)細(xì)胞系進(jìn)行鉑類藥物耐藥相關(guān)蛋白的比較蛋白質(zhì)組分析，共識別鑒定出5 種蛋白質(zhì),膜聯(lián)蛋白A3 、破解蛋白、輔酶Ⅱ依賴的異檸檬酸脫氫酶1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶omega 1 和絲切蛋白1 可能參與卵巢癌鉑類藥物耐藥機(jī)制的形成。雙向電泳技術(shù)的另一應(yīng)用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，可以提示藥物的毒性作用機(jī)制。細(xì)胞在施藥之后的代謝反應(yīng)做出實(shí)時的檢測，不僅能確定療效，也能針對毒性代謝物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)而對藥物進(jìn)行直接的改良，是一項(xiàng)意義深遠(yuǎn)的發(fā)現(xiàn)。廖國建等[15]用雙向電泳觀察鉻(六價(jià))處理后粟酒裂殖酵母在蛋白質(zhì)組水平的變化，對其中改變明顯的4 個斑點(diǎn)進(jìn)行肽指紋分析發(fā)現(xiàn),電壓依賴型陰離子通道和鋅結(jié)合醌氧化還原酶表達(dá)量降低，而S2腺苷甲硫氨酸合成酶和肌動蛋白表達(dá)量上升，說明鉻(六價(jià))可能通過氧化脅迫應(yīng)答、離子通道、氨基酸生物合成等發(fā)揮生物毒理作用，研究結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識鉻分子毒理提供了基礎(chǔ)。

5 問題與展望

目前病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究正在興起，而雙向電泳技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究工作，如通過尋找差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，尋找用于診斷的疾病相關(guān)標(biāo)記分子，尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)藥靶，以用于藥物設(shè)計(jì)，研究疾病的致病機(jī)理等。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，如液相2-DE，蛋白質(zhì)芯片結(jié)合SELDI-MS技術(shù)的應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)必將得到進(jìn)一步的發(fā)展，并在疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療方面發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)為人類疾病，特別是惡性腫瘤的早期診斷和治療方面已顯示出了廣闊的前景，必將造福于人類。

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