ApoTome光學成像系統(tǒng)

劉進 席超

北京師范大學生命科學學院

光學切片顯微技術已被廣泛地應用于生物樣本的三維熒光成像。目前最為常用的光學切片顯微技術是激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope, CLSM），CLSM利用點掃描的方法獲得清晰的光學切片。1997年，M. A. A. Neil等介紹了另外一種光學切片成像技術——結(jié)構(gòu)光學顯微鏡（structured illumination microscopy, SIM），利用該方法可以在一臺普通的熒光顯微鏡上實現(xiàn)光學切片成像[1]。

1.SIM成像原理

普通熒光顯微鏡在觀察較厚的生物樣本時，例如觀察組織切片中的多層細胞。由于受非焦平面雜散熒光的干擾，使得所獲取的熒光圖像變得模糊、對比度不夠、圖像信噪比不過高。甚至有時候一些很重要的結(jié)構(gòu)因此被掩蓋在背景之中，而無法被觀察到。SIM是將刻有均勻暗條紋的柵格插入熒光光路中（光路圖如圖1所示），因此從顯微鏡中觀察到的焦平面的圖像中有條紋的投影。帶有柵格的圖像中包含了樣本不同結(jié)構(gòu)與焦平面不同距離的信息。有些樣本的結(jié)構(gòu)在焦平面內(nèi)，而有的在焦平面的上方或者下方也進入了焦平面內(nèi)。來自非焦平面的熒光信息在圖像中顯示為比較模糊的區(qū)域。當柵格移動時，這部分區(qū)域的來自焦平面熒光信號的亮度（對比度）會顯著提高，而來自非焦平面熒光信號的亮度仍然是比較模糊的。根據(jù)這種亮度的差異，可以用來區(qū)分熒光信號是否來自于焦平面，最后再用一種算法公式通過圖像處理軟件將三張原始圖片進行計算和整合，最終得出一張全部來自焦平面熒光信號的清晰圖像。該方法也被稱為條紋投影成像技術[2,3,5,6]。

2.ApoTome光學成像系統(tǒng)介紹

德國ZEISS公司基于SIM的成像原理研發(fā)出了ApoTome光學成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)就是應用條紋投影成像技術來去除非焦平面熒光影響的。

一套ApoTome光學成像系統(tǒng)主要由以下幾個組件所組成。

2.1 一臺普通的正置或倒置熒光顯微鏡

顯微鏡上要求預留有安裝ApoTome插片的位置，例如ZEISS公司的Axio Imager.Z1/D1、Axio Observer.Z1/D1等產(chǎn)品均可擴展成為ApoTome成像系統(tǒng)。

2.2 ApoTome插片

ApoTome插片中裝有高精度的馬達和條紋柵格，ApoTome插片中的馬達可以使柵格移動至三個特定位置，每個位置可以獲得三張不同的數(shù)碼原始圖像。

2.3 ApoTome校準工具箱

工具箱中配有相應的校準工具，用于相位校準和柵格焦距校準。

2.4 數(shù)碼相機、計算機和AopTome控制軟件

用于獲取原始熒光圖像，并經(jīng)計算機處理之后生成一張最終的清晰圖像。

3.ApoTome成像效果及特點

ApoTome成像系統(tǒng)所收集的原始圖片如圖2所示，原始圖片中包含了熒光信號信息和均勻的暗色條紋。三張圖像經(jīng)過計算機處理之后可以生成一張最終圖像如圖3所示。不使用ApoTome成像系統(tǒng)所獲取的普通熒光圖像如圖4所示。經(jīng)對比之后不難發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ApoTome成像系統(tǒng)所獲取的圖像與普通熒光圖像相比，在去除原始圖像中的柵格投影后能有效地去除非焦平面的雜散熒光，顯著地增強了圖像的銳利度和對比度。

（以上由Axio Oberver Z1顯微鏡、EC Plan-Neofluar 63x/1.25 Oil物鏡所成像）

ApoTome成像系統(tǒng)主要具有以下特點：

3.1 圖像收集和處理的時間較短

由于ApoTome成像系統(tǒng)采用的是寬場照明成像，所以與CLSM的點掃描成像相比所需的時間相對較快。其圖像處理的時間取決于圖像的大小，一張512×512圖像約需30ms，一張1300×1000圖像約需100ms[7]。

3.2 圖像的縱向分辨率均一性較好

Arwed Weigel等比較了ApoTome成像系統(tǒng)與CLSM的分辨率差異。研究結(jié)果表明，觀察熒光微球時，ApoTome的縱向分辨率不如CLSM，而橫向分辨率與普通寬場熒光顯微鏡相比有很大的改善；觀察較均勻的熒光切片時，ApoTome的縱向分辨率的均一性要優(yōu)于CLSM[8]。

4.展望

ApoTome系統(tǒng)可以從熒光樣本中獲得光學切面。非焦平面的熒光能被很好地去除，可以增強圖片的銳利度，增強信噪比（對比度），增強軸向的分辨率。同時可使用傳統(tǒng)熒光光源，不需使用昂貴的激光，研究者可以最經(jīng)濟的成本獲得消除熒光影像非焦面雜光的功能。另由于軟件運算時間大大地減少，且不必要采集Z軸多層影像即可做銳化的運算處理，研究者得以迅速判斷所采集的影像的樣本優(yōu)劣，并迅速從中獲得更精確的信息，大大提高了研究的效率。最近也有研究者用非線性的柵格替代線性的柵格[4]，或者將柵格投影從二維擴展到三維投影，這些改進措施都進一步提升了SIM的成像分辨率，有的已經(jīng)甚至超過了傳統(tǒng)的CLSM。隨著，SIM的技術不斷創(chuàng)新和發(fā)展，SIM必將在生命科學研究領域做出更大的貢獻。

[1]M. A. A. Neil, R. Ju?kaitis R, and T. Wilson, Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope, Opt. Lett. 1997 22: 1905-1907.

[2]L. H. Schaefer, D. Schuster, J. Schaffer, Structured illumination microscopy: artefact analysis andreduction utilizing a parameter optimization approach, Journal of Microscopy, 2004, Vol. 216,165-174.

[3]Brakenhoff GJ, Wurpel GW, Jalink K, Oomen L, Brocks L, Zwier JM.,Characterization of sectioning fluorescence microscopy with thin uniform fluorescent layers: Sectioned Imaging Property or SIPcharts., J Microsc. 2005 Sep;219(Pt 3):122-32.

[4]Mats G. L. Gustafsson, Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution, PNAS 2005 vol. 102 no. 37 13081-13086.

[5]José-Angel Conchello, Jeff W Lichtman, Optical sectioning microscopy, Nature Methods 2, 2005, 920 - 931.

[6]Fr′ed′eric Chasles, Beno^it Dubertret and A. Claude Boccara.,Optimization and characterization of astructured illumination microscope, OPTICS EXPRESS,2007, Vol. 15, No. 24 16140.

[7]AxioVison User’s Guide, 2008.

[8]A Weigel, D Schild, A Zeug, Resolution in the ApoTome and the confocal laser scanning microscope: comparison, Journal of Bio medical Optics, 2009,14, 014022.