蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液的HPLC分析

翟 睿，張 品，董 婧

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽，110161； 2島津國際貿(mào)易有限公司沈陽分公司，沈陽，110161)

1 前言

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)名貴中藥，但由于其有極嚴(yán)格的寄生性和特殊的生長地理環(huán)境限制，產(chǎn)量相當(dāng)稀少。近年來，采用生物發(fā)酵的方法進(jìn)行蟲草類似物的生產(chǎn)得到較快的發(fā)展，僅浙江一省就有多家這類生產(chǎn)廠家[1,2]。大多數(shù)蟲草產(chǎn)品的生產(chǎn)廠商，把發(fā)酵菌絲體分離之后，占97%的發(fā)酵液作為廢液僅作簡單處理或直接排放掉，不僅造成環(huán)境污染，而且極大地浪費(fèi)資源[3]。蟲草菌發(fā)酵廢液中富含蟲草菌、蛋白質(zhì)、氨基酸、D—甘露糖、蟲草多糖等大量的有機(jī)物[4]。如將此廢液作為營養(yǎng)液添加入飼料中，必可使飼料中營養(yǎng)成分大幅提升，且起到了廢物再生、保護(hù)環(huán)境、節(jié)約資源的作用。

甜菜堿是從甜菜及其糖蜜中提取的一種季胺型生物堿，化學(xué)名稱為三甲胺乙內(nèi)酯[5]。為機(jī)體高效提供活性甲基，參與蛋白質(zhì)與脂類代謝，調(diào)節(jié)滲透壓，緩解應(yīng)激，促進(jìn)采食等生理作用[6]?？蓪⑻鸩藟A與蟲草菌發(fā)酵廢液一同作為營養(yǎng)液添加入飼料中，可在提高飼料營養(yǎng)的同時(shí)改善攝食動(dòng)物的食欲，使動(dòng)物在短期內(nèi)得到更多營養(yǎng)。

為便于從飼料中檢測(cè)出這種蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液，本文發(fā)展了一種同時(shí)檢測(cè)二者含量的高效液相離子交換色譜分析方法。

2. 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

依利特P230高效液相色譜系統(tǒng)(大連依利特分析儀器有限公司)：UV230+紫外-可見檢測(cè)器，P230高壓恒流泵，7725i進(jìn)樣閥(20μL定量環(huán))，R230溶劑管理器，EC 2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站，Hypersil SCX色譜柱(250 mm×4.6 mm I.D. 5 μm)；超純水儀(Sartorious，德國)，800型離心沉淀機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)；甲醇(色譜純)購自上海星可生化有限公司；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(分析純)購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

蟲草背孢發(fā)酵液廢液(簡稱蟲草廢液)取自浙江省湖州市某制藥廠。

2.2 溶液配制

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：取10mg甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容到5ml。

蟲草發(fā)酵液：取蟲草發(fā)酵液廢液(原液)2mL，經(jīng)0.2μm水膜過濾后作為原液樣品。量取原液1000mL，加入30mL(足量)預(yù)先配置好的殼聚糖絮凝劑(100mL 1%乙酸溶液+1g殼聚糖)，電磁攪拌10分鐘，靜置10小時(shí)。取2mL經(jīng)0.2μm水膜過濾后作為上清液樣品。樣品冷藏保存。

蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液樣品溶液：取0.2mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液與0.2mL蟲草發(fā)酵液溶液，混合均勻后冷藏保存。

2.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil SCX色譜柱(250 mm×4.6 mm I.D. 5 μm )；流動(dòng)相：甲醇：pH5.5磷酸緩沖溶液=10：90；檢測(cè)波長：205nm；柱溫：室溫；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20μL。

3.結(jié)果與討論

3.1 蟲草發(fā)酵廢液的分離分析

采用HPLC進(jìn)行蟲草多糖及不同種類單糖的分析已經(jīng)有很多種方法被發(fā)展[7,8]。其中大多使用反相色譜條件進(jìn)行分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)?？紤]到發(fā)酵廢液基底的復(fù)雜性，一系列色譜分離條件被研究。由于樣品中不僅含有生物大分子，也含有不同極性的化合物。采用2.3中的色譜條件，得色譜圖如圖1所示。如圖中所示，樣品中無甜菜堿檢出。

3.2 甜菜堿的分離分析

3.2.1 甜菜堿分離譜圖

甜菜堿分離檢測(cè)方法較多，但多使用反相色譜和離子交換色譜的方法進(jìn)行分離[9,10]。本文以1.3中的色譜條件對(duì)甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分離，結(jié)果如圖2中所示。其中2號(hào)峰為甜菜堿所對(duì)應(yīng)的峰。

3.2.2 線性范圍及線性回歸方程

取10mg甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品溶于1.5mL水中，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml各至1ml容量瓶，用水稀釋至1mL。測(cè)定各進(jìn)樣濃度對(duì)應(yīng)的峰面積,獲得一系列對(duì)應(yīng)的峰面積值,測(cè)定結(jié)果列于數(shù)據(jù)表1中。以甜菜堿的峰面積為Y縱坐標(biāo)，濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用最小二階乘法進(jìn)行計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù),一同列于表1中。

3.3 樣品分析

以2.3中的色譜條件對(duì)蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液組成的樣品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3中所示。其中4號(hào)峰為甜菜堿，其余峰均為蟲草發(fā)酵液獨(dú)有，甜菜堿與蟲草發(fā)酵液的峰分離度較好，可根據(jù)此法對(duì)含有蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液的飼料樣品進(jìn)行分析。

4. 結(jié)論

將蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液作為一種飼料添加劑加入飼料中不僅可以大大提高飼料中營養(yǎng)成分，還可以促進(jìn)動(dòng)物的攝食行為，使動(dòng)物在短期內(nèi)獲得更多營養(yǎng)。本文發(fā)展的這種同時(shí)測(cè)定飼料中蟲草發(fā)酵廢液和甜菜堿含量的方法，可很好的分離甜菜堿與蟲草發(fā)酵廢液中各組分。為測(cè)定飼料中蟲草/甜菜堿復(fù)合飼料營養(yǎng)液的含量提供了較好的分離分析平臺(tái)。

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