原料乳中抗生素定性檢測-發(fā)酵酸度法研究

李琴 軒詩海

（1.黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江省 哈爾濱 150078）

牛奶，是一種非常健康和營養(yǎng)的食品。然而，乳牛因?yàn)榧膊≈委煻没虮蛔⑸淇股仡愃幬锲錃埩粑飼?huì)存在于牛奶中。當(dāng)人類長期食用了含有抗生素殘留物的牛奶，會(huì)引起一系列不良反應(yīng)，尤其是一些毒副作用較大或質(zhì)量低劣藥物。如過敏反應(yīng)、被具有抗生素耐藥性的食源性病原體感染、以及致畸作用等。因此，牛奶中抗生素殘留對人類健康的危害不僅是一個(gè)公共衛(wèi)生和食品安全問題，也會(huì)給國家?guī)斫?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

抗生素類藥物廣泛地應(yīng)用于乳牛的各種感染性疾病，其品種繁多，例如：β-內(nèi)酰胺類（青霉素、頭孢菌素）；磺胺類；氨基糖甙類（鏈霉素、慶大霉素）；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、羅紅霉素）；氯霉素類；林可霉素類（林可霉素、克林霉素）；抗細(xì)菌的抗生素（磷霉素）等等。

目前國際上常用的獸藥殘留免疫學(xué)快速檢測方法主要有傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金法及SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法，均存在檢測種類不能全部覆蓋的缺陷。

發(fā)酵酸度原理是：在經(jīng)殺菌的牛乳中，添加嗜熱鏈球菌培養(yǎng)，在樣品中不含有抗生素情況下，嗜熱鏈球菌將繁殖，發(fā)酵牛乳，牛乳凝固產(chǎn)酸，3小時(shí)內(nèi)酸度可達(dá)70°T；如樣品中含有抗生素，嗜熱鏈球菌的繁殖將受到抑制，導(dǎo)致牛乳凝固狀態(tài)不好，產(chǎn)酸量少，3小時(shí)內(nèi)酸度無法達(dá)到70°T。從而判斷牛乳中是否有抗生素殘留。因嗜熱鏈球菌對抗生素極敏感，各類抗生素對其均有抑制作用，所以發(fā)酵酸度法可有效對牛乳中抗生素殘留進(jìn)行初篩，達(dá)到控制有抗奶的目的。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備和材料

1.1.1 滅菌鍋：115℃±1℃

1.1.2 冰箱：0℃～4℃

1.1.3 恒溫培養(yǎng)箱：43℃±1℃

1.1.4 顯微鏡：10×～100×

1.1.5 托盤藥物天平：0g～500g，精確至0.5g

1.1.6 錐形瓶：1000mL、500mL、200mL、100mL

1.1.7 溫度計(jì)：0℃～100℃

1.1.8 滅菌試管：16mm×160mm、18mm×180mm及相應(yīng)的試管架

1.1.9 滅菌吸管：1 mL、5 mL、10 mL

1.1.10 接種燈和接種環(huán)

1.2 試劑

1.2.1 嗜熱鏈球菌（Streptococcus Thermophilus）：

1.2.2 0.1mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2.3 脫脂乳粉：無抗生素。

1.3 制備及驗(yàn)證

1.3.1 菌株活力的制備

1.3.1.1 按無菌操作要求，用接種環(huán)挑取適量凍干的嗜熱鏈球菌接種于一支或兩支脫脂乳培養(yǎng)基試管中，搖勻后于43℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，至凝乳結(jié)實(shí)、無乳清析出。培養(yǎng)過程中要及時(shí)觀察并記錄凝乳時(shí)間。

1.3.1.2 選取凝乳較好的一支試管，從中吸取0.2～0.3ml凝乳，再接種于兩支試管中，搖勻后于43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至凝乳結(jié)實(shí)、無乳清析出時(shí)取出繼續(xù)傳代，按GB/T 5409檢測酸度。

1.3.1.3 當(dāng)培養(yǎng)基在3.5-4.5小時(shí)凝固，凝乳酸度達(dá)到70oΤ時(shí)，鏡檢確認(rèn)菌株符合嗜熱鏈球菌形態(tài)后即可認(rèn)為菌株活力完全恢復(fù)。

1.3.1.4 菌株的保存：培養(yǎng)至穩(wěn)定的菌株可于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，根?jù)菌株自身特性進(jìn)行定期傳代，一般為七天一次。

1.3.2 菌株活力驗(yàn)證：

1.3.2.1 鏡檢：革蘭氏染色試驗(yàn)，于100倍的油鏡顯微鏡下觀察菌體。

1.3.2.2 每一代均要鏡檢，判斷菌株是否正?；蜃儺?，如變異或污染雜菌需重新更換菌株。

1.3.3 培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱取120g無抗生素脫脂乳粉溶于880ml，50℃-60℃的蒸餾水中，充分溶解后分裝于錐形瓶100mL、10mL試管中；用滅菌鍋115℃滅菌20分鐘，冷卻后放置冰箱中備用。

檢測用菌液的制備：將菌株活力按需要擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)培條件與菌株活化一樣，接種量為2～3%，培養(yǎng)溫度43℃，發(fā)酵酸度達(dá)70oΤ。擴(kuò)培后菌液放入冰箱中備用(放置時(shí)間不能超過一周)。

1.4 操作步驟

1.4.1 樣品處理：液體樣品取200ml，固體樣品準(zhǔn)確稱量24克，溶于176ml，50-60℃的蒸餾水中，充分溶解后放置30分鐘，然后進(jìn)行水浴殺菌，殺菌條件為95℃，10分鐘。

1.4.2 樣品發(fā)酵：將殺菌后樣品溶液冷卻至45℃進(jìn)行接種，接種量為3%（無菌操作），充分搖勻后放入43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2小時(shí)取樣檢測酸度，酸度檢驗(yàn)按GB/T 5409規(guī)定進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照實(shí)驗(yàn)：取酶聯(lián)免疫試劑盒檢測為陽性的牛奶樣品5個(gè)，進(jìn)行發(fā)酵酸度試驗(yàn)，結(jié)果見表1：

2.2 添加實(shí)驗(yàn)：取無抗牛乳為本底樣品，人為添加磺胺嘧啶，添加量分別為：5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg，進(jìn)行發(fā)酵酸度試驗(yàn)，結(jié)果見表2：

3 結(jié)論

發(fā)酵酸度法可有效對牛乳中抗生素殘留進(jìn)行初篩，方法處理簡單，易操作，試驗(yàn)成本低，分析周期短，因此該方法可作為原料奶抗生素的快速篩選檢測方法。