酶抑制-比色法在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

杜美紅，孫永軍，汪 雨，陳舜琮

(北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

酶抑制-比色法在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

杜美紅，孫永軍，汪 雨，陳舜琮

(北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

概述酶抑制-比色法在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的檢測(cè)原理、對(duì)不同種酶源的選擇與保存、酶抑制法檢測(cè)條件及改進(jìn)方法等研究進(jìn)展，并指出酶抑制-比色法在使用中存在的問題和未來的發(fā)展趨勢(shì)。

酶抑制法；農(nóng)藥殘留；快速檢測(cè)；比色法；有機(jī)磷類；氨基甲酸酯類

蔬菜中的農(nóng)藥殘留問題近年來成為輿論焦點(diǎn)，同時(shí)也引起了政府的關(guān)注[1-3]。但是蔬菜是種特殊的農(nóng)產(chǎn)品，其保鮮時(shí)期很短，流通環(huán)節(jié)不宜過長，如果用常規(guī)的檢測(cè)方法，沒等檢測(cè)完畢，蔬菜就已經(jīng)失去了食用價(jià)值。另外，這類農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問題較多、較嚴(yán)重，易引發(fā)急性中毒事件，因此用于檢測(cè)蔬菜、水果中的有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酶抑制法快速檢測(cè)技術(shù)備受重視[4-6]。

1 酶抑制法檢測(cè)原理

酶抑制法是研究最多且相對(duì)成熟的一種對(duì)部分農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)[7-9]。我國已將其列入國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)》中作為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。該法測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留具有快速、簡便、靈敏及成本低等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大基層監(jiān)督部門、生產(chǎn)基地及市場(chǎng)的歡迎[10-11]。

其主要原理是在一定的條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶催化水解的功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。利用這一特性，在酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中加入底物和顯色劑觀察顏色的變化或測(cè)定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號(hào)的變化，可判斷有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥是否殘留。這種利用酶抑制產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)比色測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法稱為比色法。

2 不同種酶源的選擇與保存

酶源選擇是酶抑制法應(yīng)用的基礎(chǔ)，其性質(zhì)好壞、特異性大小、穩(wěn)定性強(qiáng)弱直接關(guān)系檢測(cè)結(jié)果。不同種類、不同來源的酶源，對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響有較大差異。檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用的酶，既有來源于動(dòng)物的也有來源于植物的，并且所提取的方法也不相同。

2.1 動(dòng)物酶源

動(dòng)物酶源應(yīng)用廣泛，由于方法本身對(duì)酶純度要求不太高，因此，一般方法提取的酶液便可滿足需要[12-13]。王小瑜等[14]以商品乙酰膽堿酯酶(來自家蠅)和自制的雞肝乙酰膽堿酯酶(AChE)、鯉魚腦AChE為研究對(duì)象，比較3種不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥(氧化樂果、敵百蟲和敵敵

畏)對(duì)這3種酶的酶活力抑制率。結(jié)果表明，3種農(nóng)藥對(duì)家蠅AChE的抑制率最高；對(duì)雞肝和鯉魚腦AChE的抑制率比家蠅AChE低；3種AChE對(duì)氧樂果都不敏感。張慧君等[15]以商品AChE和自制雞肝酶為農(nóng)藥檢測(cè)用酶，比較了不同濃度的敵敵畏、敵百蟲、馬拉硫磷和西維因?qū)@兩種酶的抑制情況。結(jié)果表明，雞肝酶的AChE酶活力較低，而其總酯酶活力對(duì)4種農(nóng)藥的靈敏度與商品AChE活力的靈敏度相近，且總酯酶活力對(duì)除馬拉硫磷外的其余3種農(nóng)藥的檢出限都較AChE低。同時(shí)對(duì)總酯酶活力測(cè)定的pH值進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)pH6.5時(shí)總酯酶活力較高。王學(xué)貴等[16]運(yùn)用酶抑制-比色法，以菜青蟲AChE作為實(shí)驗(yàn)酶源，測(cè)定了四川雅安地區(qū)的四季豆、生菜、鳳尾等5種蔬菜中氧化樂果的殘留量。Valdés-Ramirez等[17]選用電鰻電器官、基因重組果蠅(B394)及野生果蠅提取的AChE分別進(jìn)行靈敏度比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因重組果蠅(B394)所提取的AChE 檢測(cè)敵敵畏的檢測(cè)限為7×10-11mol，野生果蠅所提取的AChE檢測(cè)限為1× 10-8mol，電鰻電器官所提取的AChE檢測(cè)限為6×10-6mol。余孝穎[18]用酶電極法研究了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)3種不同生物來源的AChE的選擇性抑制，發(fā)現(xiàn)敵敵畏對(duì)家蠅的AChE抑制最強(qiáng)，電鰩AChE次之，雞肝AChE陽性弱反應(yīng)，同時(shí)研究了5種農(nóng)藥對(duì)電鰩AChE的選擇性抑制能力，發(fā)現(xiàn)9.8×10-8mol/L辛硫磷即可抑制其活性的10%。

2.2 植物酶源

植物酯酶檢測(cè)農(nóng)藥殘留可以達(dá)到與動(dòng)物膽堿酯酶相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度和精密度。植物酯酶酶源豐富，取材方便，在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中應(yīng)用前景更加廣闊。李治祥等[19]應(yīng)用植物酯酶的抑制技術(shù)，測(cè)定蔬菜水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的簡易薄層-植物酶抑制(TLC-EI)法。該法對(duì)多種農(nóng)藥的最小檢出量為納克級(jí)，最小檢出質(zhì)量濃度為0.01mg/L，添加回收率在80%以上。黃志勇等[20]在通過正交試驗(yàn)優(yōu)化膽堿酯酶與植物酯酶的測(cè)定條件下，比較對(duì)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)定，其加標(biāo)回收率都在85%以上。但植物酯酶法測(cè)定結(jié)果較好，精密度為3%。林素英等[21]研究了各種不同豆類來源酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性得出綠豆、黑豆來源酯酶的總酯酶活力和敏感性最好。朱霞萍等[22]基于α-乙酸萘酯和固藍(lán)B在面粉酶的催化作用下生成紫紅色的偶氮化合物，而有機(jī)磷農(nóng)藥在雙氧水的活化下會(huì)抑制酶的催化作用，其抑制程度與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，由此建立了一種快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的方法。探討了最佳的反應(yīng)條件，測(cè)定甲基對(duì)硫磷和甲胺磷的線性范圍分別為l～10μg/mL和l～50μg/mL，最低檢出限分別為0.1136、0.3525μg/mL。溫艷霞等[23]證實(shí)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)最佳的植物酯酶來源為黃豆種子，不僅總酯酶含量高而且對(duì)敵敵畏、對(duì)硫磷、久效磷等幾種農(nóng)藥殘留最低檢測(cè)限可達(dá)到我國或歐盟規(guī)定的最低允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)的要求。穆隨選等[24]通過對(duì)6種木本植物的總酯酶活力、比活力、農(nóng)藥敏感性和最低檢測(cè)限的測(cè)定，得出國槐的總酯酶活力是小麥的1.53倍，刺槐總酯酶活力是小麥的2.036倍，比活力是小麥的1.17倍，而側(cè)柏、灑金柏、杜仲和臘梅酯酶總活力和比活力均低于小麥，實(shí)驗(yàn)表明刺槐為適宜的植物酶源?？堤旆诺萚25]為了快速檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留狀況，分別從京9428、京9583、京東8A、京2小麥中提取植物酯酶，將這些酶用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，采用分光光度法比較了不同質(zhì)量濃度對(duì)硫磷對(duì)小麥酯酶活力的抑制情況：結(jié)果表明，不同品種小麥酯酶對(duì)于對(duì)硫磷的敏感度不同，在所研究的小麥酯酶中，京2酯酶對(duì)對(duì)硫磷最為敏感，其檢測(cè)限達(dá)到3.0×10-7mg/L。于基成等[26]利用酶抑制法快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，以小麥為對(duì)照，比較了大豆、玉米、綠豆等10種植物中植物酯酶活性，優(yōu)化了植物酯酶提取條件。同時(shí)系統(tǒng)地研究了酶促反應(yīng)條件，建立了酶抑制法快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。研究結(jié)果表明，以綠豆中提取的粗酶酶活力最高，提取條件為：以0.1mol/L pH值為6.2的磷酸緩沖液為提取劑，按固液比1:5(m/V)加料，在40℃攪拌20min，過濾。最佳酶促反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系0.1mol/L pH6.0磷酸緩沖液、反應(yīng)時(shí)間15min、反應(yīng)溫度40℃、顯色時(shí)間10min、測(cè)定波長520nm處吸收峰值；樣品提取用含10%乙醇的0.1mol/L pH6.4的磷酸緩沖液超聲波振蕩10min；方法的回收率為86.7%～97.1%，最小檢出限為0.13～0.24 μg/mL。錢立立等[27]用電動(dòng)流動(dòng)分析和酶抑制法測(cè)定池塘水中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留折合總量。酶抑制法用面粉酯酶，有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥作酶抑制劑，底物的酶解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，用分光光度計(jì)在波長524nm處檢測(cè)。有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的折合濃度對(duì)數(shù)線性范圍為0.02～0.20mg/L氧化樂果，檢出限為0.01mg/L氧化樂果，每小時(shí)可測(cè)24個(gè)樣品。氨基甲酸酯在80℃完全水解，而有機(jī)磷部分水解，據(jù)此可判斷農(nóng)藥類別。

2.3 微生物酶源

在一些文獻(xiàn)中也有采用微生物作為酶源的，如Walz等[28]從鐮刀菌pisi中提取角質(zhì)酶，利用酶抑制分光光度法和96孔板法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的含量，該法對(duì)毒死蜱和對(duì)氧磷的檢測(cè)限分別為2.6mg/L和0.04mg/L。

2.4 保存及穩(wěn)定性

目前，國內(nèi)市場(chǎng)上農(nóng)藥殘留檢測(cè)酶試劑主要有凍干工藝生產(chǎn)的固態(tài)酶和傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的液態(tài)酶兩種，為了提升保存的質(zhì)量不少研究人員對(duì)其保存條件及保護(hù)劑做

了大量研究。周艷利等[29]對(duì)大豆酶穩(wěn)定性的研究得出在4℃保存30d，酶活力損失較少；在－20℃保存30d，完全失活；在50℃以下，pH值在6.0～9.0保存10min，酶活力無明顯變化；保護(hù)效果好的保護(hù)劑依次為牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖和甘油。周艷明等[30]利用冷凍干燥方法并在干燥過程中加入5%的聚乙二醇可以有效的保護(hù)酶制劑不失活，植物酶干粉在室溫下保持一個(gè)月以后仍能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。蔡琪等[31]通過添加2%正丁醇、5%蔗糖、1%動(dòng)物血清白蛋白及自制高效保護(hù)劑，在保持所研制的農(nóng)藥殘留檢測(cè)膽堿酯酶高檢測(cè)靈敏度的前提下，使該液態(tài)酶試劑的保存性得到很大提高，冷藏條件下可長期保存，室溫保存15d酶活性無明顯下降，37℃高溫條件下放置2周仍能保持60%以上的酶活性。

3 酶抑制法檢測(cè)條件

酶是一種生物催化劑，其反應(yīng)速度受溫度、pH值、環(huán)境中離子、酶抑制劑等因素影響，一方面應(yīng)盡量避免環(huán)境因素的影響，另一方面也要開發(fā)改良反應(yīng)體系。

3.1 酶反應(yīng)最佳條件

影響測(cè)定誤差大小的因素很多，諸如酶和底物來源及濃度，反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等，因此其重現(xiàn)性不佳。李順等[32]通過正交試驗(yàn)和極差分析得出酶抑制法快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的最佳檢測(cè)條件為：抑制時(shí)間15min、抑制溫度35℃、底物加入量100μL、酶液加入量100μL。董杰等[33]對(duì)利用家蠅頭部AChE檢測(cè)有機(jī)磷殘留量探索了最佳條件，其研究結(jié)果表明：家蠅初羽化至羽化后第15天，其頭部AChE的酶活力逐漸升高((0.4483±0.0104)～(0.7769±0.0189)μmol/(mg·min))，而酶源蛋白質(zhì)的含量逐漸下降((187.0222±9.0213)～(83.0222±7.1111)μg/頭)。羽化后2～4d，其頭部AChE的敏感度最高；初羽化和羽化后第15天，敵敵畏的IC50分別是羽化后第3天的1.4倍和2.1倍。在一定的pH值范圍內(nèi)(6.6～8.0)，家蠅頭部AChE的酶活力隨緩沖液pH值的升高而增大。王文祥等[34]研究了磷酸緩沖液pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物、酶用量對(duì)兔血清AChE活力測(cè)定的影響，結(jié)果表明，供試AChE活力最佳條件是：磷酸緩沖液(pH8.0)3.0mL、顯色劑0.6%二硫雙對(duì)硝基苯甲酸(DTNB) 50μL、0.75%酶液(pH8.0)100μL、反應(yīng)溫度35℃。混勻穩(wěn)定后加入底物l%碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)50μL。反應(yīng)l80s后在波長412nm處測(cè)定光密度。在上述條件下，測(cè)定結(jié)果表明有機(jī)磷殺蟲劑丙硫磷(prothiofos)質(zhì)量濃度在0.0125～0.4g/mL，保育時(shí)間5～30min與AChE抑制率之間存在良好的相關(guān)性，可根據(jù)檢測(cè)需要調(diào)整保育抑制時(shí)問。楊東鵬等[35]提出了新的最適條件確定標(biāo)準(zhǔn)，即保證酶的活性保持在一定水平的基礎(chǔ)上(0.1333min-1≤k1≤2667min-1)，選擇抑制率(以甲胺磷為抑制劑)最高時(shí)的溫度和pH值作為最適條件。確定了抑制時(shí)間為10min時(shí)的最適條件為：抑制溫度47.0℃，pH7.7。進(jìn)而在此最適條件下確定了新的檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)酶抑制率≥58%時(shí)，蔬菜中含有某種有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留為陽性。裘正軍等[36]通過單因素對(duì)比試驗(yàn)研究了吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化關(guān)系、溫度對(duì)酶活性的影響及農(nóng)藥殘留濃度與酶抑制率的關(guān)系。結(jié)果表明吸光度隨反應(yīng)時(shí)間逐漸增加，反應(yīng)前期增速快，線性度好，適合測(cè)量；酶在20～40℃時(shí)具有最佳的活性，靈敏度高；農(nóng)藥殘留對(duì)酶的抑制作用明顯，當(dāng)抑制率高于70%時(shí)可判定農(nóng)藥殘留超標(biāo)。張叔平等[37]為快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留，建立了一種快速檢測(cè)方法——酶抑制率法，確立了最優(yōu)化條件，得出了普遍公式，根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)允許殘留限量可知其對(duì)應(yīng)的抑制率閾值。

3.2 酶反應(yīng)體系及底物

酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯色劑很多，不同的酶與底物配合使用，其檢測(cè)限不盡相同。劉文君等[38]對(duì)酶抑制法常用的底物2,6-二氯靛酚乙酸酯和固蘭B鹽進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：2,6-二氯靛酚乙酸酯較固蘭B鹽更優(yōu)越，更適合于有機(jī)磷農(nóng)藥的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。2,6-二氯靛酚乙酸酯作為底物的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：與生成物有良好的穩(wěn)定性；植物酯酶的反應(yīng)條件較為協(xié)調(diào)合理；敵敵畏對(duì)植物酯酶的抑制率與農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；用添加農(nóng)藥法測(cè)定的回收率較高。侯學(xué)文等[39]利用膽堿酯酶水解碘化酰膽堿后形成的硫代膽堿，與二硫雙對(duì)硝基苯甲酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，在波長412nm處比色測(cè)定。利用此法測(cè)定酶、底物的添加量以及保溫溫度和保溫時(shí)間對(duì)酶活力的影響，還研究了不同濃度與保溫時(shí)間的辛硫磷對(duì)膽堿酯酶活力的抑制情況。獲得了膽堿酯酶優(yōu)化的反應(yīng)條件，結(jié)果表明膽堿酯酶對(duì)辛硫磷比較敏感。周和喜[40]利用速測(cè)卡中的膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯(紅色)水解為乙酸與靛酚(藍(lán)色)。而有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥則對(duì)膽堿酯酶有抑制作用的特點(diǎn)，通過顏色變化，判斷樣品中是否存在高劑量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥。劉偉[41]采用高靈敏度的乙酰膽堿酯酶-硫代黃素T體系作為識(shí)別元素，在此體系中加入有機(jī)磷農(nóng)藥后，AChE -硫代黃素T體系特征熒光峰發(fā)射峰(波長490nm)被猝滅，熒光猝滅強(qiáng)度與農(nóng)藥濃度存在線性關(guān)系，因此可以直接確定農(nóng)藥濃度。宛梅丹等[42]建立乙酸靛酚酯-丁酰膽堿酯酶法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)反應(yīng)體系比傳統(tǒng)的膽堿酯酶-碘化硫代乙酰膽堿法測(cè)定步驟更簡便，保溫所需時(shí)間更短。劉暢等[43]以二次鹽析后的鴨血清丁酰膽堿酯酶(BchE)為農(nóng)藥殘留的檢測(cè)用酶，碘化硫代丁酰膽堿(BTChI)為底物，5-5'-二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，410nm波

長處比色測(cè)定吸光度變化，計(jì)算膽堿酯酶的抑制率，從而推算農(nóng)藥殘留情況。當(dāng)抑制率大于35%時(shí)，表明農(nóng)藥含量超標(biāo)。檢測(cè)過程只需20～40min，并可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。

4 其他改進(jìn)方法

4.1 增敏

在生物體外，有許多農(nóng)藥是酶的弱抑制劑，因此需要使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化劑，使其變成酶的強(qiáng)抑制劑。趙永福等[44]采用植物酯酶抑制法測(cè)定了蔬菜中農(nóng)藥的殘留，研究了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉對(duì)顯色體系的作用。結(jié)果表明，十二烷基硫酸鈉具有顯著的增敏效果，其增敏幅度達(dá)到70%，同時(shí)對(duì)顯色劑有增穩(wěn)作用。用所建立的方法測(cè)定蔬菜中殘留的敵敵畏，線性范圍為0.11～1.6mg/L，最低檢出限0.04mg/L。

4.2 前處理

除了有機(jī)磷和氨基甲酸酯類物質(zhì)有可能對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用外，食用植物中某些氯代煙堿類似物質(zhì)對(duì)AChE也有一些抑制作用，因此檢測(cè)過程可能出現(xiàn)假陽性。桑園園等[45]選用實(shí)際檢測(cè)中易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象的韭菜、蒜苗、蒜黃、大蒜4種蔬菜為材料，利用酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留，并對(duì)樣品前處理步驟進(jìn)行改進(jìn)，增加了對(duì)樣品提取液加熱處理，達(dá)到消除假陽性的目的。結(jié)果表明，對(duì)樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)加熱可以起到消除假陽性的作用，且不會(huì)造成殘留農(nóng)藥的損失。蒜苗、蒜黃、大蒜、洋蔥的最佳處理溫度分別為110、100、120、80℃，在達(dá)到相應(yīng)最佳消除溫度后，假陽性影響消失，且加熱時(shí)間對(duì)假陽性影響不顯著。王琳玲等[46]研究了萃取技術(shù)對(duì)酶抑制效果的影響，結(jié)果表明，利用亞臨界水萃取技術(shù)在萃取溫度70℃，萃取時(shí)間5min，提取液pH8.0，提取液體積為5mL的條件下，滅多威有最高萃取效率。黃永春等[47]對(duì)現(xiàn)存農(nóng)藥快速檢測(cè)技術(shù)中提取效率問題進(jìn)行研究，當(dāng)添加農(nóng)藥后的時(shí)間間隔為2h時(shí)，添加的農(nóng)藥主要以簡單吸附持留在蔬菜表面，80%～98%的添加農(nóng)藥可以被提取出來，隨著時(shí)間間隔的延長(至5h)，采用表面沖洗的農(nóng)藥提取效率急劇下降，大部分農(nóng)藥的提取效率為20%～60%，簡單表面沖洗法在實(shí)際應(yīng)用中很難將蔬菜中殘留的農(nóng)藥提取出來。馮國棟等[48]開發(fā)出一種用于大米、面粉、水果、蔬菜等樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速前處理方法和化學(xué)試劑盒。并且討論了影響現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的主要因素，對(duì)大多數(shù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出下限可達(dá)0.1～3.0mg/kg。王琦[49]在不同條件下分別處理油菜、甘藍(lán)、蘋果上的甲胺磷和氧化樂果農(nóng)藥殘留，確定了不同處理劑的去農(nóng)藥殘留效果和較佳處理?xiàng)l件。與此同時(shí)，測(cè)定不同處理劑在不同處理?xiàng)l件下對(duì)油菜、甘藍(lán)、蘋果營養(yǎng)品質(zhì)的影響，以最終確定最佳處理?xiàng)l件。鐘樹明等[50]應(yīng)用植物酶抑制技術(shù)檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥。用小柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可去除葉綠素的干擾、提高檢測(cè)靈敏度。提出了抑制率閾值(15%)。應(yīng)用此方法對(duì)市售蔬菜的農(nóng)藥殘留進(jìn)行調(diào)查，檢出率約為10%。

5 問題與展望

綜上所述，盡管酶抑制-比色法在快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留中有廣泛應(yīng)用，但它仍然存在一些問題。由于酶結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，即使同樣酶源的酶在不同生產(chǎn)批次對(duì)同種農(nóng)藥也會(huì)出現(xiàn)一定差異，而且同一批次的酶對(duì)不同種農(nóng)藥的靈敏度也有很大差異，所以容易出現(xiàn)假陽性或假陰性。由于比色法檢測(cè)以吸光度變化計(jì)算相應(yīng)酶的抑制率，植物體的內(nèi)容物如氧化酶次生物質(zhì)葉綠素、花青素等必然會(huì)對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生干擾，檢測(cè)液的顏色會(huì)有變化，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果專一性、準(zhǔn)確率、可比性等都存在問題。

農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)是一件嚴(yán)肅認(rèn)真的工作，不僅需要可靠的儀器及方法更需要規(guī)范的操作和健全的制度。隨著各類技術(shù)縱向的發(fā)展與橫向的聯(lián)用，農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的瓶頸問題勢(shì)必會(huì)得到解決。

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Advances in the Application of Enzyme Inhibition/Colorimetric Assay to the Rapid Detection of Pesticide Residues

DU Mei-hong，SUN Yong-jun，WANG Yu，CHEN Shun-cong
(Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

This paper summarizes the principles of enzyme inhibition/colorimetric assay, sources and preservation of enzymes used in the assay and enzymatic reaction conditions. In addition, the problems encountered during its application and the future development trends are pointed out.

enzyme inhibition；pesticide residues；rapid detection；colorimetry；organophosphoms；carbamates

TS207.3

A

1002-6630(2010)17-0462-05

2010-06-29

國家科技部專項(xiàng)“科學(xué)儀器設(shè)備質(zhì)量評(píng)價(jià)體系構(gòu)建”項(xiàng)目(2009IM033200)

杜美紅(1974—)，女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩治鰴z測(cè)。E-mail：dumeihong@hotmail.com