體外擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞功能有效性與移植安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展

劉晶，宋琳，鄒偉，諸葛棟，崔占峰

1 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中英再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究中心，大連 116011

2 Department of Engineering Science, University of Oxford, Oxford OX1 3PJ, U. K.

3大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院，大連 116024

4 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029

長(zhǎng)期以來(lái)，多種難治性疾病如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及自身免疫系統(tǒng)疾病等嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命，徹底治療這些疾病是人類一直未能解決的健康難題[1]。1988年世界第一株人胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cells，ESCs)系建立，其后成體干細(xì)胞的研究突飛猛進(jìn)，隨著該領(lǐng)域研究的深入，有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 治療疾病的基礎(chǔ)和臨床研究更是顯示出了令人欣慰的前景[2-3]，MSCs移植有望成為難治性疾病最有前途的治療策略。MSCs來(lái)源于多種組織，包括骨髓、臍帶血、外周血、脂肪等，但無(wú)論哪一種來(lái)源，其取材數(shù)量都是有限的，很難滿足臨床移植所需的細(xì)胞數(shù)量要求。因此科學(xué)家開(kāi)始探討體外擴(kuò)增技術(shù)，以提高干細(xì)胞數(shù)量，現(xiàn)已能在體外實(shí)現(xiàn)數(shù)倍至數(shù)十倍擴(kuò)增不等，從技術(shù)上保證了MSCs作為移植種子細(xì)胞的數(shù)量要求。但在其應(yīng)用于臨床之前，首當(dāng)其沖就是要確保其在體內(nèi)的功能有效性及移植安全性，本文就體外擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的有效性及安全性研究進(jìn)展作一綜述。

1 MSCs體外擴(kuò)增的研究現(xiàn)狀

雖然MSCs在臨床治療上的前景和地位已經(jīng)明確，但由于人體內(nèi)干細(xì)胞來(lái)源數(shù)量有限，僅靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法難以在短時(shí)間內(nèi)滿足臨床移植上對(duì)細(xì)胞數(shù)量的要求。因此，MSCs的體外擴(kuò)增方法的探索一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外已竟相開(kāi)展這方面研究工作，取得了一些進(jìn)展。目前較為成功的擴(kuò)增方法是通過(guò)生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞擴(kuò)增。Chen等[4]利用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器擴(kuò)增人骨髓 MSCs，另外添加干細(xì)胞因子 (Stem cell factor，SFC)、白細(xì)胞介素-3 (Interleukin-3，IL-3) 和 IL-6，檢測(cè)發(fā)現(xiàn) Stro-1+ CD44+CD34-的MSCs在8 d后可擴(kuò)增9倍，成纖維細(xì)胞集落形成率 (Colony-forming efficiency-fibroblast per day，CFE-F/day) 是未用生物反應(yīng)器擴(kuò)增的對(duì)照組的1.44倍，擴(kuò)增后的細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志波形蛋白 (Vimentin) 和Endoglin (SH2)，而分化細(xì)胞的標(biāo)志如II型膠原、骨鈣素 (Osteocalcin， OC) 和C/EBP-α等則未檢測(cè)到，并且這些細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞。本課題組也利用生物反應(yīng)器成功在體外擴(kuò)增出MSCs，如利用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人胎盤來(lái)源的MSCs，與用培養(yǎng)皿擴(kuò)增的對(duì)照組細(xì)胞相比較，培養(yǎng)144 h后攪拌式生物反應(yīng)器擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量是培養(yǎng)皿的 1.73倍，并且 MSCs的表型特征不變[5]。通過(guò)氣升式環(huán)流中空纖維膜生物反應(yīng)器對(duì)兔骨髓MSCs進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，7 d后可擴(kuò)增16倍，擴(kuò)增后大部分細(xì)胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，并具有較強(qiáng)的成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力[6]。這些研究表明，通過(guò)生物反應(yīng)器不但可使MSCs在數(shù)量上得到擴(kuò)增，還能夠保證MSCs維持原本的表型和分化能力，符合臨床移植用MSCs的基本生物學(xué)特征。

除了生物反應(yīng)器，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)了其他方法也有助于實(shí)現(xiàn)MSCs體外擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)表面抗原篩選可以提高M(jìn)SCs擴(kuò)增效率。一般認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原情況與造血干細(xì)胞相反，即CD31、CD34為陰性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271等為陽(yáng)性。根據(jù)這一特性，Jarocha等[7]通過(guò)免疫磁珠分離純化CD105+CD271+的人骨髓MSCs并擴(kuò)增，表達(dá)CD105和CD271的成纖維細(xì)胞集落生成單位 (Colony-forming unitfibroblastic，CFU-F) 是未純化細(xì)胞的3~4倍。此外，其他一些影響MSCs體外擴(kuò)增的因素也陸續(xù)被報(bào)道。有研究者通過(guò)改善培養(yǎng)基質(zhì)實(shí)現(xiàn)MSCs的體外擴(kuò)增，Zangi等[8]用纖維蛋白微珠可有效將MSCs從大鼠骨髓中分離并且擴(kuò)增。Kocaoemer等[9]用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血漿 (Thrombin-activated platelet-rich plasma) 分別作為擴(kuò)增用血清，對(duì)人脂肪來(lái)源的MSCs進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明第6代MSCs的擴(kuò)增倍數(shù)分別為66.6±15.7和68.1±6.7，而用胎牛血清擴(kuò)增的倍數(shù)僅為 24.4±0.7。除基質(zhì)材料與血清的優(yōu)化外，一些生長(zhǎng)因子也有利于MSCs的擴(kuò)增。如Tamama等[10]證實(shí)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Epidermal growth factor，EGF) 可通過(guò)使ERK及AKT磷酸化的途徑刺激人骨髓 MSCs增殖，F(xiàn)arre等[11]報(bào)道成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4 (Fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4) 可使 MSCs的復(fù)制周期顯著縮短且不改變其多向分化潛能。最近，Zscharnack等[12]還發(fā)現(xiàn)氧濃度也可影響 MSCs的擴(kuò)增，他們通過(guò)比較 5%和20%的氧氣濃度下MSCs的擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)5%的氧濃度下MSCs形成的CFU-F比20%的氧氣濃度多2倍，并且老化程度也比20%的氧氣濃度輕。

以上研究表明，目前已能從技術(shù)上實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，但在大規(guī)模、系統(tǒng)地應(yīng)用于臨床治療前，急需解決的問(wèn)題就是 MSCs擴(kuò)增后的功能有效性與移植安全性，即在體外大規(guī)模擴(kuò)增后，MSCs是否具有與原始干細(xì)胞相同的自我更新和多向分化潛能、表達(dá)相同的標(biāo)記蛋白，以及是否具有致瘤性和移植帶來(lái)的不良反應(yīng)，這是衡量與決定擴(kuò)增MSCs移植能否應(yīng)用到臨床治療的一個(gè)重要指標(biāo)。因此必須在移植之前，對(duì)擴(kuò)增后的MSCs進(jìn)行“身份”鑒定和安全檢查。

2 擴(kuò)增MSCs的有效性評(píng)價(jià)

擴(kuò)增MSCs的有效性評(píng)價(jià)主要基于以下幾個(gè)方面：細(xì)胞的生物學(xué)特征如細(xì)胞形態(tài)；特異性細(xì)胞抗原表達(dá)；細(xì)胞因子表達(dá)譜；細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞在一定條件下的分化能力等，即這些擴(kuò)增MSCs必須處在未分化的可以維持自我更新的狀態(tài)。

如前所述，一般認(rèn)為MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD105、SB-10、SH-3、SH-4等表面抗原，不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志如CD34，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD14，抗原呈遞細(xì)胞即成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-DR等。Bruder等[13]在 1997年就已證明在沒(méi)有任何分化誘導(dǎo)物存在的條件下，25代前的MSCs形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)及表型特點(diǎn)等無(wú)顯著性差異，即MSCs的連續(xù)傳代不會(huì)改變其基本性狀。前面闡述的包括本課題組在內(nèi)的有關(guān)大規(guī)模擴(kuò)增MSCs的研究中，也檢測(cè)了擴(kuò)增后的MSCs的表型特征，均明確提出了擴(kuò)增后的MSCs可以保持其表型不變，細(xì)胞形態(tài)也與普通條件下培養(yǎng)的MSCs相同。

MSCs具有多向分化潛能，可分化為多種中胚層組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成脂細(xì)胞等，還可誘導(dǎo)分化為非中胚層的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞[14-16]等。成骨和成脂分化能力也是目前公認(rèn)的鑒別 MSCs的方法之一。許多學(xué)者在進(jìn)行MSCs擴(kuò)增研究時(shí)檢測(cè)了擴(kuò)增后的MSCs是否具有多向分化潛能。如本課題組[6]及前面提到的Chen等[4]的研究中，均發(fā)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增后的 MSCs可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞等，能夠維持其多向分化潛能。Zhang等[17]研制的二軸生物反應(yīng)器結(jié)合聚已酸內(nèi)酯-三鈣磷酸 (Polycaprolactonetricalcium phosphate，PCL-TCP) 材料培養(yǎng)人胎兒來(lái)源的MSCs。相比于對(duì)照組，細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)形成克隆，其成骨分化能力也好于對(duì)照組。他們將反應(yīng)器擴(kuò)增出的 MSCs移植入小鼠體內(nèi)，也可有效地分化為成骨細(xì)胞。這些研究提示擴(kuò)增的MSCs具有與原始MSCs相同的特性，具備臨床應(yīng)用的功能有效性，具有作為臨床移植種子干細(xì)胞的可能性。

MSCs有廣泛的細(xì)胞因子表達(dá)譜，在體內(nèi)可通過(guò)組織間隙作用于周圍細(xì)胞，發(fā)揮重要的旁分泌作用，除誘導(dǎo)、調(diào)控造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育外，還廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、凋亡、內(nèi)源性前體細(xì)胞再生、血管再生等病理生理作用。目前發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌包括造血因子、非造血生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、趨化因子以及多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、細(xì)胞黏附作用受體[18-19]，表明 MSCs的功能可能是通過(guò)自分泌和旁分泌發(fā)揮的。特別是近幾年發(fā)現(xiàn)MSCs具有免疫抑制作用，許多學(xué)者都認(rèn)為MSCs的旁分泌是其中重要機(jī)制之一。因此MSCs的分泌作用也是判定MSCs功能有效性的標(biāo)準(zhǔn)之一。但是，追溯了近十年的文獻(xiàn)，我們并未看到關(guān)于MSCs擴(kuò)增后對(duì)其分泌作用的研究，說(shuō)明目前對(duì)擴(kuò)增后MSCs有效性的評(píng)價(jià)尚不完善，以后的研究應(yīng)重視擴(kuò)增后MSCs分泌作用的研究。

3 擴(kuò)增MSCs的安全性評(píng)價(jià)

同其他植入技術(shù)一樣，MSCs無(wú)論擴(kuò)增與否，其應(yīng)用于臨床移植所面臨的最大質(zhì)疑就是安全性評(píng)價(jià)。MSCs由于其自身特點(diǎn)，安全性中主要涉及的問(wèn)題就是致瘤性與免疫排斥。

3.1 致瘤性研究

2002年 Science雜志報(bào)道[20]，將人類胚胎干細(xì)胞植入帕金森病模型小鼠大腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)ESCs可分化為多巴胺能神經(jīng)元，對(duì)患病小鼠具有治療作用，但一些小鼠卻因ESCs轉(zhuǎn)化的畸胎瘤而死亡。這一現(xiàn)象對(duì)ESCs是否適合于臨床移植提出了質(zhì)疑。同樣，體外大規(guī)模擴(kuò)增的MSCs是否也能夠發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而具有腫瘤細(xì)胞的特性？這是擴(kuò)增 MSCs應(yīng)用于人體之前必須解決的問(wèn)題。

曾有實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的MSCs偶爾會(huì)出現(xiàn)“瘋長(zhǎng)”現(xiàn)象，2~3 d即可長(zhǎng)滿傳代。Rubio等[21]在2005年首次報(bào)道了體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng) (4~5個(gè)月) 脂肪來(lái)源的人 MSCs可自然發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。后續(xù)研究中又發(fā)現(xiàn)脂肪來(lái)源的人MSCs在惡性轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)一些與腫瘤細(xì)胞相同的基因表達(dá)特征，如p53、CDK2、CDK4、CDK6等表達(dá)均高于正常的MSCs[22]。Li等[23]也發(fā)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng) 12個(gè)月的小鼠骨髓 MSCs可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并且將 MSCs移植入老年小鼠18~24個(gè)月，小鼠體內(nèi)可見(jiàn)纖維肉瘤形成。

事實(shí)上，干細(xì)胞與腫瘤之間的關(guān)系一直是研究者廣泛關(guān)注的問(wèn)題。在關(guān)于腫瘤起源的假說(shuō)中即有腫瘤起源于干細(xì)胞的觀點(diǎn)，近幾年也提出了腫瘤干細(xì)胞這一說(shuō)法。許多學(xué)者認(rèn)為，干細(xì)胞在長(zhǎng)期的自我更新過(guò)程中 (如傳代次數(shù)或擴(kuò)增倍數(shù)過(guò)多時(shí))增殖調(diào)控途徑中某些基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，從而引起細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致癌變。例如，Serakinci等[24]利用人MSCs研究干細(xì)胞形成腫瘤的過(guò)程，將端粒酶 hTERT轉(zhuǎn)染至 MSCs中構(gòu)建細(xì)胞系hMSC-TERT20，當(dāng)細(xì)胞群體倍增水平 (Population doubling level) 達(dá)到256時(shí)，細(xì)胞失去接觸抑制。將這些細(xì)胞注射入10只小鼠，均能在體內(nèi)形成腫瘤。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hMSC-TERT20細(xì)胞系由于啟動(dòng)子超甲基化，細(xì)胞周期相關(guān)基因DBCCR1表達(dá)缺失，從而發(fā)生癌變。

前面提到的 Zhang等[17]研制的二軸生物反應(yīng)器，他們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后的 MSCs移植入小鼠體內(nèi)后并未發(fā)現(xiàn)腫瘤。在更高級(jí)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物也獲得令人欣慰的結(jié)果，Liu等[25]用流式細(xì)胞儀分離 Flk-1(+)CD31(-)CD34(-)的猴和人骨髓來(lái)源的MSCs，體外擴(kuò)增6代之后移植入活體內(nèi)，宿主無(wú)任何異常。這些結(jié)果提示在擴(kuò)增倍數(shù)適當(dāng)?shù)那闆r下MSCs移植宿主可能不會(huì)致瘤。

但是，經(jīng)擴(kuò)增后的MSCs在應(yīng)用于臨床治療之前對(duì)其致瘤性進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)和全面評(píng)估以確保人體移植的安全是十分必要的。目前檢測(cè)致瘤性的主要方法有：形態(tài)學(xué)觀察；細(xì)胞周期檢測(cè)；刀豆蛋白 A凝集試驗(yàn) (檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)改變)；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) (檢測(cè)錨定非依賴性生長(zhǎng)，Anchorage independent growth)；細(xì)胞核型分析；動(dòng)物體內(nèi)致瘤性；組織化學(xué)等，現(xiàn)有的擴(kuò)增MSCs致瘤性評(píng)價(jià)也是基于以上檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為了充分保證擴(kuò)增MSCs移植的安全性，有必要從腫瘤細(xì)胞的多種特性入手，建立更全面的致瘤性評(píng)價(jià)體系。

3.2 免疫抑制作用

造血干細(xì)胞是最早應(yīng)用于臨床移植的干細(xì)胞，已有過(guò)移植后出現(xiàn)不良反應(yīng)的報(bào)道，主要的并發(fā)癥之一是移植物抗宿主病 (Graft verous host disease，GVHD)。GVHD是指供體的免疫活性細(xì)胞對(duì)免疫功能低下的受體抗原產(chǎn)生排斥反應(yīng)的疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成患者死亡。因而免疫排斥問(wèn)題一直被認(rèn)為是干細(xì)胞臨床治療的一大安全障礙，擴(kuò)增MSCs能否應(yīng)用于臨床首先也需要評(píng)價(jià)其免疫排斥能力。目前已證實(shí)，MSCs不表達(dá)MHCII類分子、FasL、B7-1、B7-2、CD40等，低表達(dá)MHCII類分子，從理論上將可避免受體免疫系統(tǒng)的殺傷作用。2000年，Liechty等[26]在妊娠早期的胎羊免疫功能發(fā)育前后，分別將人MSCs植入胎羊體內(nèi)。在這樣一個(gè)異基因體系中，人MSCs可存活長(zhǎng)達(dá)13個(gè)月之久，移植后的MSCs還可分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。令人驚奇的是，在胎羊免疫功能發(fā)育后，人MSCs也能長(zhǎng)期存活而無(wú)排斥反應(yīng)。他們因此預(yù)言了 MSCs在臨床移植、組織工程及細(xì)胞、基因治療方面的巨大潛能，這要?dú)w功于MSCs的一項(xiàng)獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)——低免疫原性[27]。

2003年Tse等[28]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MSCs與同種外周血單核細(xì)胞或同種異體T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，MSCs不會(huì)引起T細(xì)胞的增殖，也不能刺激外周血單核細(xì)胞釋放 γ-干擾素，而作為對(duì)照組的成纖維細(xì)胞則能夠刺激這一過(guò)程，這表明MSCs具有免疫抑制作用。Ye等[29]的研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓MSCs與同種異體CD3+的T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，在T細(xì)胞增殖受抑制的同時(shí)，致炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平降低，抗炎癥因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (Transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10的水平增高。進(jìn)一步研究表明，MSCs對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制具有 2個(gè)特點(diǎn)：一是免疫效應(yīng)為劑量依賴性[28]，即MSCs的數(shù)量越多，抑制效果越強(qiáng)。二是這種免疫抑制效果是可逆的[30]，即在有刺激物如植物血凝素 (Phytohaemagglutinin) 存在時(shí)將MSCs移去，T細(xì)胞的增殖即可回復(fù)到無(wú)MSCs存在時(shí)的水平。除T細(xì)胞外，MSCs還能抑制B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞 (Dendritic cells，DCs) 及自然殺傷(Natural killer，NK) 細(xì)胞的增殖，并且均不會(huì)引起它們的凋亡[31-35]。

鑒于這一特性，目前許多臨床研究中甚至嘗試?yán)肕SCs治療一些疾病如GVHD、I型糖尿病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。Ringden等[36]給8位患有類固醇抗藥性的3-4級(jí)急性GVHD患者和1位廣泛性慢性 GVHD患者注入平均為 1×106個(gè)MSCs細(xì)胞/kg體重，結(jié)果顯示其中6位急性患者痊愈 (除1位患有巨型細(xì)胞病毒急性胃腸炎)。另外2位注射MSCs后無(wú)明顯效果，死亡。5位患者在移植后2個(gè)月至3年內(nèi)仍存活，存活率顯著高于同時(shí)期未經(jīng)MSCs治療的另外16位GVHD患者。Le Blanc等[37]于2001年10月至2007年1月跟蹤了55位急性GVHD的患者，細(xì)胞來(lái)自HLA相同同胞供體、單倍體相同的供體和第三方HLA不全相合供體。研究發(fā)現(xiàn)其中30位患者完全治愈，9位患者病情得到改善。在注射MSCs期間和注射之后無(wú)患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，治愈程度與供體的 HLA匹配程度無(wú)關(guān)。I型糖尿病是T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)對(duì)胰臟的β細(xì)胞攻擊的一種疾病，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)MSCs可降低T細(xì)胞活性從而阻止其侵入到胰島而引發(fā)糖尿病，Vija等[38]還證實(shí)MSCs可抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)新生胰島 β細(xì)胞的攻擊。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA) 也是由自身免疫障礙導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊關(guān)節(jié)的慢性免疫性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)[39-41]，在體外MSCs可抑制T細(xì)胞的增殖、免疫應(yīng)答及其產(chǎn)生的因子如 γ-干擾素和TNF-α，降低炎癥反應(yīng)并抑制來(lái)自RA患者滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)降解酶，因而是一種很有潛力的治療膠原誘導(dǎo)性 RA的新方法，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也取得了較好的效果。Gonzalez等[42]將人脂肪來(lái)源的MSCs注入到患有膠原誘導(dǎo)性 RA的小鼠中，成功緩解了病情，并且降低了發(fā)病率。

由此看來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制特性使其在臨床應(yīng)用上的安全性高于其他成體干細(xì)胞，許多學(xué)者認(rèn)為MSCs將在預(yù)防GVHD、排斥反應(yīng)及細(xì)胞治療等領(lǐng)域能夠發(fā)揮有效作用。遺憾的是，目前仍缺乏關(guān)于擴(kuò)增后的MSCs是否能夠完整保持免疫抑制及抗GVHD特性的研究。本課題組自行研制灌注式三維微生物反應(yīng)器，利用灌注細(xì)胞系統(tǒng)和三維細(xì)胞培養(yǎng)的雙重優(yōu)勢(shì)，通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)灌注細(xì)胞培養(yǎng)使反應(yīng)器的環(huán)境更接近細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，并實(shí)現(xiàn)了微環(huán)境的流動(dòng)變化效應(yīng)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用該反應(yīng)器培養(yǎng)MSCs，能夠逼真地模擬循環(huán)的體內(nèi)微環(huán)境，較好地支持MSCs的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)高效、可重復(fù)MSCs體外擴(kuò)增[43]。下一步我們計(jì)劃利用該微生物反應(yīng)器開(kāi)展MSCs體外擴(kuò)增，進(jìn)而深入研究擴(kuò)增后MSCs的致瘤性及抗GVHD特性。希冀不久的將來(lái)能夠?qū)U(kuò)增后的MSCs免疫抑制作用有一個(gè)完整系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，為擴(kuò)增后的MSCs臨床應(yīng)用上的安全性論證提供依據(jù)。

4 展望

毋庸置疑，MSCs移植給嚴(yán)重危害人類生命、降低人類生活質(zhì)量疾病的治療帶來(lái)了無(wú)限希望，MSCs擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展也為在體外獲取足量種子細(xì)胞提供了可能，但畢竟MSCs臨床應(yīng)用的研究尚屬起步階段，擴(kuò)增 MSCs更是由于其在體外所經(jīng)歷的復(fù)雜培養(yǎng)過(guò)程及輔助試劑、藥物的參與等，在臨床應(yīng)用前還有諸多問(wèn)題需要解決。必須在獲得穩(wěn)定擴(kuò)增效果的基礎(chǔ)上構(gòu)建一個(gè)立體全面的擴(kuò)增MSCs有效性、安全性的評(píng)價(jià)體系，保證MSCs臨床治療安全化、規(guī)范化，才能推動(dòng)MSCs的臨床應(yīng)用進(jìn)程。

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