雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定

李軍華，韓翠芹，鄧捷，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，楊凌 712100

生物技術(shù)與方法

雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定

李軍華，韓翠芹，鄧捷，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，楊凌 712100

利用DNA同源重組方法 (基因打靶) 對動物基因組進行修飾是轉(zhuǎn)基因研究的重要手段之一。為了構(gòu)建一個高效的通用型基因打靶載體，本研究以pBS246質(zhì)粒為骨架，在兩個LoxP序列之間插入正篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因和綠色熒光蛋白 (EGFP) 基因；在兩個 LoxP序列外側(cè)分別插入兩組攜帶“8堿基”酶切位點的多克隆位點序列(MCS-1和MCS-2) 和負(fù)篩選標(biāo)記單純皰疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk) 基因，構(gòu)建成通用型基因打靶載體pGT-V1，并且在C2C12細(xì)胞中驗證了載體中各個元件的功能。該載體具有如下特點：1) 在載體中引入綠色熒光標(biāo)記，可以實時監(jiān)控載體的轉(zhuǎn)染效率，而轉(zhuǎn)染效率的提高為高效基因打靶提供了保證；2) 在兩個 LoxP位點間插入綠色熒光標(biāo)記，可以直觀監(jiān)測打靶后遺留的篩選標(biāo)記的去除情況，并且可以通過流式細(xì)胞儀或免疫磁珠法，將最終去除了篩選標(biāo)記的陽性細(xì)胞(即丟失綠色熒光的細(xì)胞) 分選出來，降低篩選標(biāo)記在中靶細(xì)胞中可能產(chǎn)生的負(fù)面影響；3) 采用“8堿基”酶切位點的MCS序列，便于DNA大片段的連接和重組，極大提高了該載體的通用性?？傊?，該載體優(yōu)化了基因打靶的技術(shù)手段，為有效開展基因打靶和轉(zhuǎn)基因動物研究提供了新平臺。

同源重組，綠色熒光標(biāo)記，打靶載體，Cre-LoxP

Abstract:Homologous recombination is an important technique that is used to modify mammalian genome. Here, we constructed an efficient common gene targeting vector based on the plasmid pBS246. The vector consisted two positive selection markers,neomycin resistance gene (neo) and enhanced green fluorescent protein gene (EGFP) flanked by locus of X-over P1 (LoxP) sites.Two synthesized multiple cloning sequences MCS-1 and MCS-2 that contain several “8 bp cutter” enzyme sites were placed in outside of LoxP sites. Additionally, a negative selection markerHSV-tk(herpes simplex virus thymidine kinase) gene was located adjacent to MCS-1 site. The constructed vector was named pGT-V1, and its functions were characterized in C2C12 cells. The vector had the following unique features: 1)EGFPwas used to monitor instantly the transfection rate that was essential for increasing the efficiency of gene knockout (KO); 2) TheEGFPmarker located between two LoxP sites was able to be removed from KO positive cells to avoid the potential damage of selection markers to the recipient cells. The process could be monitored visually and the positive cells without selecting markers (the loss of green fluorescent cells) could be sorted out by either flow cytometry orimmunomagnetic beads; 3) “8 bp cutter” restriction sites were embedded in MCS sequences, which then enhanced the versatility of this vector. In summary, the constructed plasmid optimized the vector of gene targeting and provided a new technique means for the transgenic animal research.

Keywords:homologous recombination, green fluorescent protein gene, gene targeting vector, Cre-LoxP

基因打靶技術(shù)是建立在上世紀(jì) 80年代基因同源重組和胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的，它將外源基因定點整合到靶細(xì)胞基因組的某一特定位點上，或?qū)δ骋话形稽c進行定點突變，以達(dá)到對細(xì)胞基因組進行定點修飾的目的，最終改變生物的遺傳特性[1]。1981年 Martin[2]和 Evans等[3]成功建立了小鼠胚胎干細(xì)胞系 (ES細(xì)胞)，使得基因打靶技術(shù)能夠?qū)嶋H應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物研究中。1985年，Smithies等[4]首次利用同源重組方法將一段外源質(zhì)粒插入到人染色體 β-globin位點上，從而最早在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了同源重組。1988年，Capecchi等運用“正負(fù)篩選”策略，將2個篩選標(biāo)記基因neo和HSV-tk裝到打靶載體上，使中靶細(xì)胞的效率比僅使用單一正篩選標(biāo)記提高了3～10倍[5]。傳統(tǒng)的基因打靶將靶基因在細(xì)胞或動物體中的活性完全去除，很容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或胚胎早期發(fā)育缺陷。因此，Gu等[6]將Cre-LoxP 基因元件引入到打靶載體上，把在特定發(fā)育階段或特定組織細(xì)胞中表達(dá)Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，與在基因組中引入LoxP錨定序列的小鼠交配，使子代鼠中特定組織細(xì)胞中的靶基因被去除。這種具有時空調(diào)控特性的條件基因去除技術(shù)為研究重要功能基因在組織器官發(fā)育、生理過程以及疾病發(fā)生中的作用提供了有效的研究手段。

基因打靶技術(shù)已經(jīng)成功運用于轉(zhuǎn)基因羊[7]、牛[8]、豬[9]等實驗研究上。但是，目前國內(nèi)外常用的打靶載體都或多或少的存在一些缺陷，例如，有的載體中引入一種抗藥基因作為正篩選標(biāo)記，但并沒有設(shè)計好中靶細(xì)胞篩選完成后將篩選標(biāo)記去除的步驟，結(jié)果導(dǎo)致中靶細(xì)胞中永久攜帶正篩選標(biāo)記，這可能是造成體細(xì)胞克隆效率低下和克隆動物流產(chǎn)率、畸胎率較高的一個原因。還有一些打靶載體在抗藥基因兩端加入了 LoxP序列，打靶完成后通過Cre-LoxP系統(tǒng)去除中靶細(xì)胞中的正篩選標(biāo)記，但是他們忽略了一個重要問題：如何有效地將去除正篩選標(biāo)記的中靶細(xì)胞篩選出來？因為轉(zhuǎn)染的效率無法達(dá)到100%，Cre酶的工作效率也無法達(dá)到100%。為克服上述不足，有必要構(gòu)建一個更為完善的基因打靶載體。本研究在2個LoxP序列之間插入neo作為正篩選標(biāo)記的同時，再插入EGFP序列，這樣基因打靶完成后，通過觀察綠色熒光的變化，就可以實時監(jiān)測中靶細(xì)胞的篩選情況。最重要的是，可以通過流式細(xì)胞儀或免疫磁珠法將去除篩選標(biāo)記的中靶細(xì)胞篩選出來。因此，本研究對動物轉(zhuǎn)基因研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

成肌細(xì)胞C2C12、大腸桿菌菌株DH5α、TOP10由本中心保存；pIRES-neo、pEGFP-C1載體購自Clontech公司；pBS246、pBS185載體和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000購自 Invitrogen公司；pORF-HSV1tk載體購自InvivoGen公司；限制性內(nèi)切酶購自MBI公司；T4 DNA連接酶、Klenow大片段、T4 DNA磷酸激酶、DNA marker等購自TaKaRa公司；G418、DMEM干粉 (高糖)、胎牛血清購自 Gibco公司；丙氧鳥苷 (GAC) 購自Sigma公司；DNA片段快速回收試劑盒購自BioDev-tech公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自Vigrous公司。

1.2 載體的構(gòu)建

1.2.1載體構(gòu)建的技術(shù)路線圖

載體構(gòu)建經(jīng)過3個大的步驟，具體技術(shù)路線見圖 1。

1.2.2構(gòu)建過渡載體pING

將載體pEGFP-C1經(jīng)NheⅠ單酶切和Klenow補平后再用BglⅡ單酶切，并通過凝膠電泳回收EGFP片段，然后將其插入到經(jīng)EcoRⅤ和BamHⅠ雙酶切的pIRES-neo中，得到pING載體，并分別用BglⅡ和KpnⅠ進行單酶切鑒定。

圖1 載體構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow diagram of vector construction.

1.2.3構(gòu)建過渡載體pBS246/tk

分別合成2段含多個“8堿基”酶切位點的DNA小片段，MCS-1 (5′?3′)：AATTCGCCCGGGCCCTCA GCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGC TAGC 和 MCS-2 (5′?3′)：CTAGTTAATTAAGGCCG GCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACC A。將2個片段分別插入到pBS246載體的EcoRⅠ位點 (MCS-1) 和SpeⅠ/NdeⅠ位點 (MCS-2) 處，得到 pBS246/MCS。然后用EcoRⅠ單酶切pBS246/MCS，經(jīng)Klenow補平后，再用NotⅠ單酶切，凝膠回收線性化的pBS246/MCS；NotⅠ/SwaⅠ/AseⅠ三酶切 pORF-HSV1tk，凝膠回收含有啟動子及 ployA序列的HSV-tk片段，最后將HSV-tk序列克隆到線性化的pBS246/MCS中，構(gòu)建成pBS246/tk載體。分別用SmaⅠ、PstⅠ單酶切，以及PacⅠ和AscⅠ雙酶切進行鑒定。

1.2.4構(gòu)建通用打靶載體pGT-V1

XhoⅠ單酶切 pING，經(jīng) Klenow補平后再用NruⅠ單酶切，電泳回收EGFP/IRES/neo目的片段。將目的片段連接到經(jīng)BamHⅠ單切及Klenow補平后的pBS246/tk載體上，構(gòu)建完成pGT-V1載體。分別用KpnⅠ和SpeⅠ單酶切進行鑒定。

1.3 載體相關(guān)元件的功能檢測

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物篩選濃度測定

小鼠成肌細(xì)胞 C2C12在含 10%胎牛血清的H-DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37℃、5%CO2飽和濕度。待細(xì)胞生長至 70%～80%滿時，將C2C12細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別加入不同濃度的G418和GAC篩選1周，統(tǒng)計G418和GAC的最低致死濃度。

1.3.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及其抗藥性檢測

用NotⅠ位點將pGT-V1載體線性化，然后通過電穿孔方法將pGT-V1導(dǎo)入C2C12細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，并在培養(yǎng)基中加入最低致死濃度的G418進行藥物篩選，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞作為陰性對照組，2～3周內(nèi)觀察細(xì)胞抗藥的結(jié)果。挑選抗G418的細(xì)胞克隆，再在培養(yǎng)液中加入篩選濃度的GAC，對中靶細(xì)胞進行負(fù)篩選。同時，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞作為陰性對照組，1周內(nèi)觀察結(jié)果。

1.3.3Cre-LoxP系統(tǒng)的功能驗證

質(zhì)粒 pBS185帶有Cre基因，通過電穿孔法將10 μg pBS185質(zhì)粒導(dǎo)入帶有 G418抗性的 106細(xì)胞中。同時，以相同體積的超純水轉(zhuǎn)染作為陰性對照，24 h后熒光顯微鏡下觀察電轉(zhuǎn)染前后綠色熒光細(xì)胞比例的變化。然后通過流式細(xì)胞儀分選EGFP陽性和陰性細(xì)胞，計算Cre酶對LoxP序列進行剪切、重組的效率?？紤]到電轉(zhuǎn)染效率無法達(dá)到 100%，所以對已轉(zhuǎn)染過 1次的細(xì)胞待重新貼壁后，進行第 2次電轉(zhuǎn)染，以便進一步檢測Cre-LoxP元件的功能。另外，為在基因組水平上進一步檢測Cre-LoxP系統(tǒng)的功能，在陽性細(xì)胞中導(dǎo)入 Cre酶后，提取基因組DNA，并以未轉(zhuǎn)染Cre酶的陽性細(xì)胞作為對照，通過半定量 PCR驗證轉(zhuǎn)染 Cre酶后細(xì)胞基因組上的EGFP含量變化。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 50s，30個循環(huán) (GAPDH：27個循環(huán))；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，然后通過全自動凝膠成像分析儀Gene genius掃描，目的片段與內(nèi)參的光密度之比作為目的片段的相對光密度值，通過EXCEL軟件對實驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體酶切鑒定及分析

2.1.1pING的鑒定

將目的基因EGFP序列克隆到載體 pIRES-neo中，得到pING陽性質(zhì)粒 (圖2A)。pING經(jīng)BglⅡ酶切得到1 937 bp和3 839 bp兩個片段，經(jīng)KpnⅠ酶切得到1 565 bp和4 411 bp兩個片段。電泳結(jié)果與設(shè)計相符 (圖2a)，證明pING載體構(gòu)建正確。

2.1.2pBS246/tk的鑒定

將合成的多克隆位點序列MCS-1插入到pBS246的EcoRⅠ位點處，MCS-2插入到SpeⅠ/NdeⅠ位點間，構(gòu)建完成 pBS246/MCS。最后，將包括啟動子及ployA序列的HSV-tk克隆入 pBS246/MCS，構(gòu)建完成 pBS246/tk (圖 2B)。用SmaⅠ和PstⅠ單酶切 pBS246/tk質(zhì)粒分別得到 4 484 bp、44 bp和2 328 bp、2 200 bp片段；用PacⅠ和AscⅠ雙酶切得到4 300 bp和228 bp兩個片段 (圖2b)，這些結(jié)果均與設(shè)計相符，證明pBS246/tk載體構(gòu)建正確。

2.1.3pGT-V1的鑒定

通過平末端連接的方法，將帶有EGFP/IRES/neo的基因片段克隆到 pBS246/tk中，構(gòu)建完成pGT-V1 (圖2C)。用KpnⅠ單酶切pGT-V1質(zhì)粒得到3 764 bp、1 716 bp和1 565 bp三個片段，用SpeⅠ單酶切得到3 496 bp、2 130 bp和1 419 bp三個片段(圖2c)，結(jié)果均與設(shè)計相符。

圖2 重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖及酶切鑒定Fig.2 Schematic of recombinant plasmids and the enzyme mappings. (A) Structure of pING. (a) pING digested by enzymes. 1:BglⅡ digestion; 2:KpnⅠ digestion. (B) Structure of pBS246/tk. (b) pBS246/tk digested by enzymes. 1:SmaⅠ digestion; 2:PstⅠdigestion; 3:PacⅠ/AscⅠ double-digestions. (C) Structure of pGT-V1. (c) pGT-V1 digested by enzymes. 1:Kpn Ⅰ digestion; 2:SpeⅠdigestion. M: molecular weight marker.

2.2 pGT-V1載體的功能驗證

2.2.1G418和GAC最低致死濃度測定

經(jīng)過1周的濃度梯度篩選，C2C12細(xì)胞用G418處理的最小致死濃度是 400 μg/mL，因此，采用400 μg/mL G418濃度用于篩選。C2C12細(xì)胞用6 μmol/L GAC處理后全部致死，而在用 4 μmol/L GAC時大部分細(xì)胞仍能存活，所以GAC的篩選濃度定為 4 μmol/L。

2.2.2熒光標(biāo)記和正負(fù)篩選標(biāo)記功能的檢測

采用電穿孔方法將pGT-V1導(dǎo)入C2C12細(xì)胞，對照組細(xì)胞不加質(zhì)粒以同樣條件電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，實驗組有30%左右的細(xì)胞發(fā)綠色熒光 (圖3A)，而對照組沒有觀察到綠色熒光 (圖3B)。隨后，在培養(yǎng)液中加入400 μg/mL G418進行藥物抗性篩選，每2天換液1次。7～10 d左右，對照組細(xì)胞幾乎全部死亡，而實驗組也有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞死亡，然后將G418的濃度減為200 μg/mL，繼續(xù)篩選。3周后，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)G418抗性細(xì)胞克隆。將G418抗性細(xì)胞擴增培養(yǎng)，在熒光鏡下檢測發(fā)現(xiàn)，視野內(nèi)觀察的細(xì)胞都發(fā)綠色熒光 (圖3C)，證明成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGT-V1的細(xì)胞株。

在檢測負(fù)篩選標(biāo)記基因時，將轉(zhuǎn)染 pGT-V1的陽性細(xì)胞培養(yǎng)在 4 μmol/L GAC的培養(yǎng)液中，經(jīng)過4～5 d的生長，實驗組細(xì)胞全部死亡 (圖3D1)，而未轉(zhuǎn)染pGT-V1的對照組細(xì)胞仍然存活(圖3D2)。此結(jié)果證明HSV-tk整合到細(xì)胞染色體基因組上，并能正常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.2.3Cre-LoxP功能的檢測

為驗證pGT-V1載體上的Cre-LoxP基因元件是否有功能，我們將帶有Cre酶的質(zhì)粒pBS185 (10 μg)通過電穿孔法導(dǎo)入EGFP陽性的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞比例的變化。對比未轉(zhuǎn)染Cre酶的EGFP陽性細(xì)胞組 (圖4A)，轉(zhuǎn)染了Cre酶的細(xì)胞組中有一定比例的細(xì)胞丟失了綠色熒光 (圖4B)，表明這些中靶細(xì)胞內(nèi)位于LoxP區(qū)間的藥物篩選標(biāo)記和EGFP基因已被Cre酶清除。為定量分析Cre酶去除LoxP片段的效率，我們采用流式細(xì)胞儀對 Cre酶處理的細(xì)胞進行了定量檢測。以未轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞作為陰性對照 (圖4C1)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EGFP陽性細(xì)胞經(jīng)流式儀定量檢測后發(fā)現(xiàn)，有83.4%的細(xì)胞為EGFP陽性，16.6%的細(xì)胞為EGFP陰性 (圖4C2)。而經(jīng)過Cre酶處理后的EGFP陽性細(xì)胞組，有 61.2%的細(xì)胞為EGFP陽性，38.8%的細(xì)胞為EGFP陰性。與未經(jīng)Cre酶處理的組比較，丟失綠色熒光的細(xì)胞數(shù)增加了22.2% (圖4C3)。由于電轉(zhuǎn)染效率達(dá)不到100%，從而影響了Cre酶去除LoxP片段的效率。因此，我們對第1次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又進行了1次電轉(zhuǎn)染，經(jīng)第2次Cre酶處理后，丟失綠色熒光的細(xì)胞比率提高到59.9% (圖4C4)。以上結(jié)果表明，經(jīng)過 Cre酶處理后，約 1/2的EGFP陽性細(xì)胞去掉了LoxP片段。在基因組水平上通過半定量PCR實驗證明，與對照組相比，Cre酶處理的EGFP陽性細(xì)胞組內(nèi)，EGFP基因的含量明顯減少(圖4D)。以上結(jié)果表明，通過對EGFP的監(jiān)控，證明了Cre酶能有效地將LoxP位點間的打靶篩選標(biāo)記基因從靶細(xì)胞的基因組中去除。

3 討論

對染色體DNA進行修飾有多種手段，如病毒載體轉(zhuǎn)染[10]、轉(zhuǎn)座子方法[11]、鋅指核酸酶方法[12]等，但目前普遍采用的主要還是基因打靶方法?；虼虬械牟呗灾饕姓?fù)篩選標(biāo)記法、啟動子或 PolyA捕獲法、標(biāo)記靶基因融合法、鋅指核酸酶法等[13-14]。上述方法各有其特點，但也存在一些問題，例如，對某基因座進行定點敲除，必須要在打靶載體上連入相應(yīng)的同源臂，而同源臂自身往往帶有多個酶切位點，這就為同源臂克隆入打靶載體帶來了極大的困難。許多商品化和自建的打靶載體，要么缺少多克隆位點，要么載體上的多克隆位點都是常見的酶切位點，往往會與同源臂自身所帶的酶切位點相同，這就給長、短臂DNA片段的連接重組帶來了困難。其次，一方面許多打靶載體缺少必要的篩選標(biāo)記，給打靶后的陽性細(xì)胞篩選帶來困難。另一方面一些帶有正/負(fù)篩選標(biāo)記的打靶載體，不能有效去除打靶后在中靶細(xì)胞內(nèi)遺留的篩選標(biāo)記，因為攜帶某些篩選標(biāo)記有可能會影響中靶細(xì)胞的正常生理功能，或影響體細(xì)胞胚胎克隆效率。最重要的是，在大動物細(xì)胞的基因打靶研究上，許多攜帶Cre-LoxP系統(tǒng)的打靶載體，由于缺乏有效的篩選手段，無法篩選出去除篩選標(biāo)記的陽性細(xì)胞克隆，從而未能發(fā)揮Cre-LoxP系統(tǒng)應(yīng)有的功能，為轉(zhuǎn)基因研究帶來極大不便。鑒于以上問題，我們在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計構(gòu)建了一個帶有neo/HSV-tk正負(fù)篩選標(biāo)記和綠色熒光篩選標(biāo)記的雙篩選標(biāo)記打靶載體。該載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞后，一方面通過neo和HSV-tk的正負(fù)篩選可以有效地富集陽性細(xì)胞克隆，另一方面，通過將綠色熒光標(biāo)記與Cre-LoxP系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)成一個基因打靶篩選標(biāo)記去除監(jiān)測系統(tǒng)，這個系統(tǒng)既可以監(jiān)測打靶后期neo等篩選標(biāo)記的去除情況，又可以利用綠色熒光標(biāo)記有效地將去除篩選標(biāo)記的陽性細(xì)胞篩選出來，完善了基因打靶技術(shù)。

圖3 熒光及正負(fù)篩選標(biāo)記基因的檢測Fig.3 Fluorescence detection and anti-drugs selection. (A)C2C12 cells transfected with pGT-V1 (24 h). 1: fluorescence; 2:phase contract. (B) C2C12 cells without transfection. (C) The positive clones selected by G418. 1: fluorescence; 2: phase contract. (D) G418 resistant cells selected by GAC (5 days). 1:cells selected by GAC; 2: C2C12 cells without transfection.

圖4 Cre-LoxP系統(tǒng)功能驗證Fig.4 Cre-LoxP function analysis. (A) The pGT-V1 stable-transfected cells. 1: fluorescence; 2: phase contract. (B)The pGT-V1 stable-transfected cells were transfected with plasmid pBS185 that contains Cre gene. 1: fluorescence; 2:phase contract. (C) The flow cytometry analysis of Cre treated cells. 1: C2C12 cells as the negative control; 2: pGT-V1 stable-transfected cells; 3: Cre treatment for once; 4: Cre treatment for twice. (D) Semi-quantitative PCR determination ofEGFPgene content. 1: pGT-V1 stable-transfected cells without Cre treatment; 2: pGT-V1 stable-transfected cells with Cre treatment.

在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，在陽性克隆篩選完成后，通過熒光顯微鏡觀察，視野內(nèi)的細(xì)胞全部發(fā)出綠色熒光 (圖3C)，但是通過流式細(xì)胞儀進行定量檢測卻發(fā)現(xiàn)，只有83.4%的細(xì)胞為EGFP陽性(圖4C2)。這提示我們，通常通過抗藥性篩選得到的陽性克隆很可能是不純的，有部分細(xì)胞克隆是假陽性的。我們構(gòu)建的載體pGT-V1就很好地克服了這種弊端，陽性克隆篩選完成后，可以利用綠色熒光通過流式細(xì)胞儀進行初步分選，避免了假陽性造成的干擾。另外，在對Cre-LoxP系統(tǒng)的功能進行驗證的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Cre酶處理后的EGFP陽性細(xì)胞組，有 61.2%的細(xì)胞為EGFP陽性，38.8%的細(xì)胞為EGFP陰性。與未經(jīng)Cre酶處理的組相比，丟失綠色熒光的細(xì)胞數(shù)增加了22.2% (圖4C3)。這提示我們：如果沒有EGFP的熒光標(biāo)記進行實時監(jiān)測，很難保證Cre酶去除LoxP片段的效率，從而導(dǎo)致最終得到的標(biāo)記基因去除的陽性細(xì)胞少之又少。由于電轉(zhuǎn)染效率達(dá)不到100%，因此會影響Cre酶去除LoxP片段的效率。于是，我們對第 1次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又進行了1次電轉(zhuǎn)染，經(jīng)第2次Cre酶處理后，丟失綠色熒光的細(xì)胞比率提高到59.9% (圖4C4)，證明了我們構(gòu)建的基因打靶載體能夠精確監(jiān)測Cre-LoxP系統(tǒng)的工作效率。但是，由于質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染會出現(xiàn)多拷貝隨機整合的情況，篩選完成后在中靶細(xì)胞基因組上能出現(xiàn)多個LoxP位點，通過Cre介導(dǎo)的剪切重組會出現(xiàn)多種情況。這與在載體中連入同源臂后進行基因打靶后只會整合單拷貝的載體還是有所不同的。

在該載體中引入了“8堿基”酶切位點組成的2個多克隆位點元件：MCS-1和MCS-2。理論上計算“8堿基”酶切位點在DNA序列中出現(xiàn)的機率是“6堿基”酶切位點的1/16，平均在5～6 kb長度上才有可能出現(xiàn)一個“8堿基”酶位點，因此解決了在打靶片段與載體連接時出現(xiàn)的酶切位點沖突的困擾，極大地方便了打靶同源臂的連接。目前國內(nèi)外將打靶載體導(dǎo)入受體細(xì)胞所采用的方法主要是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔法，這2種方法都存在一個轉(zhuǎn)染效率的問題，要想提高基因打靶的效率，首先要提高載體轉(zhuǎn)染的效率。利用載體中引入的綠色熒光標(biāo)記可以直觀地估計每次轉(zhuǎn)染的效率，不斷地摸索轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，從而保證了基因打靶的效率。最后，在基因打靶完成后的篩選過程中，通過觀察綠色熒光我們可以實時監(jiān)測中靶細(xì)胞的篩選情況，對陽性克隆的篩選進度有了直觀的了解，有效地避免了常規(guī)篩選存在的盲目性和不可預(yù)知性。另外，本研究是以小鼠的成肌細(xì)胞C2C12作為細(xì)胞模型對抗藥性元件進行驗證的，由于不同物種和類型的細(xì)胞對藥物的敏感性是不同的，所以在對大動物進行體細(xì)胞的基因打靶研究時，G418和GAC的的篩選濃度還需要重新進行測定。

總之，本研究在總結(jié)傳統(tǒng)打靶載體的基礎(chǔ)上，設(shè)計了雙篩選標(biāo)記，使基因打靶技術(shù)更加完善，并且具有廣泛應(yīng)用價值，為動物遺傳育種和轉(zhuǎn)基因動物克隆研究提供新的技術(shù)手段。

REFERENCES

[1] Müller U. Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector design to phenotype analysis.Mech Dev, 1999, 82(1/2): 3?21.

[2] Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.Proc Natl Acad Sci USA,1981, 78(12): 7634?7638.

[3] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.Nature, 1981,292(5819): 154?156.

[4] Smithies O, Gregg RG, Boggs SS,et al. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination.Nature, 1985, 317(6034):230?234.

[5] Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogeneint-2 in mouse embryo-derived stem cells:a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.Nature, 1988, 336(6197): 348?352.

[6] Gu H, Marth JD, Orban PC,et al. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting.Science, 1994, 265(5168):103?106.

[7] McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS,et al. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells.Nature, 2000, 405(6790): 1066?1069.

[8] Sendai Y, Sawada T, Urakawa M,et al. alpha1,3-Galactosyltransferase-gene knockout in cattle using a single targeting vector with loxP sequences and cre-expressing adenovirus.Transplantation, 2006, 81(5):760?766.

[9] Lai LX, Kolber-Simonds D, Park KW,et al. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science, 2002, 295(5557): 1089?1092.

[10] Chapman SC, Lawson A, Macarthur WC,et al. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector.Development, 2005, 132(5): 935?940.

[11] Brune W. Random transposon mutagenesis of large DNA molecules inEscherichia coli.Methods Mol Biol, 2002,182: 165?171.

[12] Bibikova M, Carroll D, Segal DJ,et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.Mol Cell Biol, 2001, 21(1): 289?297.

[13] García-Otín AL, Guillou F. Mammalian genome targeting using site-specific recombinases.Front Biosci, 2006, 11:1108?1136.

[14] Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y,et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases.Science,2009, 325(5939): 433.

Construction and functional analysis of a common gene targeting vector with double-selection markers

Junhua Li, Cuiqin Han, Jie Deng, and Huayan Wang

Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling712100,China

Received:March 22, 2010;Accepted:May 14, 2010

Supported by:Grants of New Transgenic Technology and Method (No. 2008X08010-001), National Major Special Project on New Varieties Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2009ZX08007-008B).

Corresponding author:Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

轉(zhuǎn)基因新技術(shù)新方法研究 (No. 2008X08010-001)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (No. 2009ZX08007-008B) 資助。