雞傳染性喉氣管炎的診斷

薛春宜，曹永長，王林果，畢英佐

（1.中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642）

雞傳染性喉氣管炎的診斷

薛春宜1，曹永長1，王林果2，畢英佐2

（1.中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642）

傳染性喉氣管炎病毒(ILTV）是一種能夠引起雞急性上呼吸道感染的皰疹病毒。由它所引起的疾病稱為雞傳染性喉氣管炎。該病毒在分類上屬于皰疹病毒科α亞科，學名為雞皰疹病毒I型(gallid herpesvirus l ）。1925年，該病首先報道于美國，并命名為氣管-喉頭炎，后又稱為傳染性支氣管炎，支氣管肺炎等。1963年Gruiehk shank在電鏡下觀察負染標本，證明本病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)同單純皰疹病毒一致后，才明確了引起ILT的病毒屬于皰疹病毒。2000年，國際病毒分類委員會(ICTV）將ILTV從水痘病毒屬劃出，建立一個新屬：類傳染性喉氣管炎病毒屬，這個屬唯一的病毒就是ILTV。

ILTV只有一種血清型，在雞上表現(xiàn)不同的毒力。與其它的皰疹病毒不同，ILTV的宿主范圍窄，幾乎只感染雞和雞源細胞。ILTV可以在雞的呼吸道上皮細胞迅速復制并能在感覺神經(jīng)元進行潛伏感染。感染ILTV的雞呼吸困難、咳嗽、氣喘，引起喉頭氣管黏膜肥厚、腫脹、糜爛和出血。雞群感染此病毒后，發(fā)病率為90%～100%，死亡率為5%～70%(平均20%），可造成大的經(jīng)濟損失。近年來，該病己經(jīng)在包括我國在內(nèi)的世界范圍內(nèi)，特別是養(yǎng)雞業(yè)集中的地區(qū)傳播，已經(jīng)成為養(yǎng)雞業(yè)的重要疫病之一。

在自然條件下，本病主要侵害雞，雖然各種年齡的雞均可感染，但以成年雞的癥狀最為特征。病雞及康復后的帶毒雞是主要傳染源，經(jīng)上呼吸道及眼分泌物傳染。易感雞群與接種了疫苗的雞作較長時間的接觸，也可感染發(fā)病。被呼吸器官及鼻腔排出的分泌物，污染的墊草、飼料、飲水和用具可成為傳播媒介。人及野生動物的活動也可機械傳播。種蛋蛋內(nèi)及蛋殼上的病毒不能傳播，因為被感染的雞胚在出殼前均已死亡。本病一年四季都能發(fā)生，但以冬春季節(jié)多見。雞群擁擠，通風不良，飼養(yǎng)管理不善，維生素A缺乏，寄生蟲感染等，均可促進本病的發(fā)生。此病在同群雞傳播速度快，群間傳播速度較慢，常呈地方流行性。本病感染率高，但致死率較低。該病發(fā)病機制是由于病毒在喉頭和氣管黏膜的上皮細胞中繁殖，引起這些黏膜的發(fā)炎和一部分上皮細胞中的嗜酸性核內(nèi)包涵體的形成。由病毒所致的黏膜發(fā)炎，常因兼性病原菌的侵入而惡化，在黏膜上形成纖維蛋白假膜，引起呼吸困難或窒息，病毒只侵入血液中，但并不在血液中繁殖，所以不引起病毒血癥。

該病和多種疾病常常并發(fā)，造成該病診斷比較難。這里介紹診斷該病的幾種方法。

一、初診

臨床上可根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變對該病做出初步診斷。

（一）臨床癥狀病雞伸頸張口吸氣，低頭縮頸呼氣，閉眼呈痛苦狀。多數(shù)雞表現(xiàn)精神不振，食欲下降或拒食，呼吸時發(fā)生濕性咳嗽，發(fā)出響亮的喘鳴聲，呈下蹲姿勢?？人詴r甩頭，甩出血樣痰液。從鼻流出漿液性或膿性粘液，呈半透明狀。有時眼角存在膿狀物，眼瞼腫脹，甚至封閉整個眼球。嚴重病例可見極度呼吸困難，痙攣性咳嗽，咳嗽或搖頭時咯出帶血的粘液，有的病雞因氣管內(nèi)滲出物不能咳出而窒息死亡。病雞稍瘦，雞冠和肉髯發(fā)紺。有時排出綠色、黃白色稀便，最后多因衰竭而死亡。若是產(chǎn)蛋雞，其產(chǎn)蛋量迅速下降或停止，產(chǎn)薄皮蛋、無殼蛋增多。

（二）剖檢病變剖檢病死雞可見氣管和喉頭黏膜明顯充血、出血和肥厚，氣管上皮壞死，出血性氣管炎和喉炎，氣管腔內(nèi)有大量滲出物及凝固似紅綾子樣的血性痰液，有假膜的很容易剝離；鼻黏膜充血、肥厚，腔內(nèi)有大量粘液，喉頭處有干酪樣栓子；有的病雞還伴有結(jié)膜炎變化，常見眼瞼周圍腫脹，結(jié)膜充血，水腫，有時有點狀出血，下眼瞼水腫，角膜出現(xiàn)潰瘍等病理變化。少數(shù)病雞在氣管黏膜表面有一層假膜，全身器官組織嚴重瘀血。

雞傳染性喉氣管炎的臨診癥狀和病理變化與某些呼吸道傳染病，如雞新城疫、傳染性支氣管炎有些相似，易發(fā)生誤診?，F(xiàn)場可通過以下幾點診斷：①本病常突然發(fā)生，傳播快，成年雞發(fā)生最多；發(fā)病率高，死亡因條件不同而差別大。②臨診癥狀較為典型，張口呼吸、喘氣、有啰音，咳嗽時可咳出帶血的粘液；有頭向前向上吸氣姿勢。③剖檢死雞時可見氣管呈卡他性和出血性炎癥病變，以后者最為特征；氣管內(nèi)還可見到數(shù)量不等的血凝塊；如有條件可結(jié)合病毒分離、鑒定和動物接種來進一步確診。

二、實驗室診斷

（一）病毒分離鑒定技術(shù)

1.病料采集和運輸。病料的準備：①活體采樣。用滅菌棉拭子伸入口咽或氣管采集分泌物，放入含青霉素4 000 IU/ml和鏈霉素4 000 μ g/ml的無菌生理鹽水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，處理方法同上。②尸體采樣。無菌采取病死雞喉頭和氣管，放入無菌的平皿或燒杯中，密封。

采集的樣品應(yīng)立即放入4℃冰箱保存，24 h內(nèi)送到實驗室；不能在24 h內(nèi)送到實驗室時，應(yīng)將所采樣品冷凍保存和運輸。

2.樣品處理。

（1）收到棉拭子樣品后，先凍融2次，并充分振動、擠干棉拭子，將樣品液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml、鏈霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作為接種材料。

（2）組織樣品：無菌條件下將組織剪碎，按1：4加入生理鹽水后用研磨器研磨制成20%的勻漿懸浮液，再經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml，鏈霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作為接種材料。

3.接種雞胚。取經(jīng)處理過的樣品，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜。每枚0.2 ml，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7 d，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，24～120 h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。有痘斑者，取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨后，置-20℃凍存?zhèn)溆?；無痘斑者，亦取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨，反復凍融，離心后，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜盲傳。盲傳3代以上，如仍無病變，則判為雞傳染性喉氣管炎陰性。

4.病毒鑒定。用雞傳染性喉氣管炎標準陽性血清（效價在1∶32以上）和標準陰性血清與分離物作雞胚中和試驗。

（1）血清處理。將傳染性喉氣管炎標準陽性血清和標準陰性血清56℃滅活處理30 min。

（2）病毒稀釋。將病毒分離物用含青霉素1 000 IU/ml和鏈霉素1 000μ g/ml的滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋。

（3）病毒-血清混合液。設(shè)兩排試驗管，每排4個管，第1排每管放0.6 ml標準陽性血清，第2排每管放0.6 ml陰性血清，然后向每排1～4號試驗管內(nèi)分別加入(2×10-2～2×10-5）稀釋的病毒懸液各0.6 ml，將病毒-血清懸液混合并置冰箱(4℃～8℃）4 h。

（4）雞胚接種及結(jié)果判定。取經(jīng)處理過的病毒-血清混合液，分別接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜，0.2 ml/枚，每管接種5枚，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7 d，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，24～120 h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。記錄觀察結(jié)果，按Reed-Muench方法計算EID50。

5.結(jié)果判定。如分離物能引起雞胚絨毛尿囊膜出現(xiàn)典型的痘斑，并且經(jīng)雞胚中和試驗，其陰性血清組和陽性血清組的EID50的對數(shù)之差大于或等于2.5時，則判定分離物為雞傳染性喉氣管炎病毒。

（二）瓊脂凝膠免疫擴散試驗用含8%氯化鈉的蒸餾水加萬分之一疊氮鈉配制成1%瓊脂糖，103kPa高壓蒸汽滅菌或水浴加熱使瓊脂充分溶化，加入直徑為85 mm的培養(yǎng)皿中，每皿16 ml，平置，室溫下凝固后，置4℃?zhèn)溆?。在瓊脂糖平皿上，按坐標紙上畫好的梅花型打孔，孔? mm，孔間距3 mm。挑出孔內(nèi)瓊脂，在火焰上封底。用微量移液器加樣，中央孔加抗原，1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔加待檢血清，每孔均以加滿不溢出為度。加樣完畢后，靜置10 min，放入37℃帶蓋的濕盒中反應(yīng)，分別在12 h、24 h、36 h觀察并記錄結(jié)果。被檢樣品孔與中央孔之間形成清晰的沉淀線，并與標準陽性血清孔的沉淀線相融合者為陽性。被檢血清孔與抗原之間無沉淀線，標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線直伸向被檢血清孔的邊沿無彎曲者，判為陰性。

（三）血清中和試驗（SN）將ILTV特異性的血清和待檢病料一起孵育后接種雞胚或細胞進行血清中和試驗，根據(jù)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）上或細胞的痘斑數(shù)量的有無或多少判定，檢測自然感染或試驗感染的血清抗體時，ILTV接種后一周即可測出中和抗體。

（四）包涵體檢查用棉拭子采取發(fā)病后2～3 d雞喉頭黏膜上組織制成切片，姬姆薩染色、鏡檢。取發(fā)病后2～3 d的雞喉頭黏膜上制成切片后，姬姆薩染色，鏡下發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有紫色、周圍有暈輪狀的包涵體即可判為陽性。

（五）動物回歸試驗以病毒分離物經(jīng)氣管內(nèi)途徑接種易感雞，然后常規(guī)飼養(yǎng)，記錄發(fā)病情況，3～7 d后撲殺檢查。具體操作如下：取病雞氣管分泌物，按1∶5加生理鹽水稀釋，用棉簽蘸取稀釋液涂擦喉頭和上腭，接種60日齡易感雞10只，再用生理鹽水接種同日齡雞10只作對照。3～7 d后可見感染雞出現(xiàn)ILT典型臨床癥狀和病理變化，易感雞出現(xiàn)呼吸困難，流淚，結(jié)膜發(fā)炎，眶下竇，鼻竇腫脹。剖檢病雞發(fā)現(xiàn)喉頭和氣管出血嚴重，而對照組均無異常變化。

（六）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）該方法可以快速、敏感地做出診斷，一次可檢測多個樣品，可用于ILTV抗體的檢測和定量，但對抗原的純度要求很高。具體操作方法可參考試劑盒說明書進行。

（七）分子生物學診斷

1.PCR檢測。聚合酶鏈式反應(yīng)簡稱PCR，是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝的分子生物學技術(shù)。

采用病毒DNA抽提試劑盒，直接從疑似ILT感染病料，或者病料接種后獲得的病毒產(chǎn)物中提取DNA。采用1對特異性引物d00565-1（5’-GGCAACGGATTC CGGCATTTAGTC-3’）/d00565-2（5’-GACGCCTCCCGACATTCAA GTTTT-3’），按下列反應(yīng)程序進行PCR擴增：95℃3 min；94℃40 s，58℃ 40 s，72℃ 40 s，共進行 30個循環(huán)；然后72℃保溫10 min。用1%濃度的瓊脂凝膠電泳，120V30 min，見有335bp大小的帶即可判定為陽性，否則為陰性。

2.分子雜交技術(shù)。該技術(shù)的運用使ILTV不同毒力的鑒別，以及與其他禽病毒的區(qū)分成為可能。不僅對鑒定ILTV提供安全有效的手段，而且能快速、簡便地檢出潛伏期感染的ILTV，但不能可靠地在原始病料中檢出病毒。

3.環(huán)介導的等溫擴增技術(shù)。環(huán)介導等溫擴增 (LAMP） 是最近開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增技術(shù)。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域, 設(shè)計4種特異引物，利用一種反轉(zhuǎn)錄酶（AMV反轉(zhuǎn)錄酶）和一種鏈置換DNA聚合酶(Bst dNA polymerase）在恒溫(65℃左右）中保溫1 h左右，即可完成核酸擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳觀察，或者直接靠擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進行判斷，也可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果。本實驗室針對傳染性喉氣管炎病毒的胸苷激酶基因（TK），設(shè)計一套引物，在65℃下反應(yīng)1 h，可以檢測到目標產(chǎn)物，其靈敏度比常規(guī)PCR技術(shù)高10倍。

三、鑒別診斷

臨床上傳染性喉氣管炎與雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽霍亂等有部分相似，需做好鑒別診斷。必要時要根據(jù)實驗室檢測結(jié)果做出科學的診斷。

（一）雞新城疫 雞新城疫和傳染性喉氣管炎病原都是病毒，傳染快，發(fā)病率高，同樣有呼吸困難病狀。但傳染性喉氣管炎無神經(jīng)癥狀及拉稀等消化道癥狀。病理變化局限于喉部和氣管，呈現(xiàn)出血性或假膜性喉炎及氣管炎。

（二）雞傳染性支氣管炎傳染性支氣管炎主要感染30日齡以內(nèi)的雛雞，也出現(xiàn)呼吸困難，但表現(xiàn)為支氣管炎及肺炎病變明顯。而傳染性喉氣管炎侵害較大日齡的雞(4～12個月）。病變在氣管及喉部，其中含大量粘液性、壞死性物質(zhì)。

（三）黏膜型雞痘如呼吸困難，口腔檢查亦見喉頭處被干酪樣物所堵塞，病死雞剖檢可見喉頭、氣管栓塞等癥狀與傳染性喉氣管炎極相似。但黏膜型雞痘在喉頭處黏膜可見隆起的單個或融合在一起的灰白色痘斑。一般不見氣管的急性出血性炎癥。

（四）禽霍亂禽霍亂往往僅流行于個別雞群或小范圍，若在同一地區(qū)雞鴨鵝同時大批發(fā)病死亡，則可能是禽霍亂，而不是傳染性喉氣管炎。禽霍亂病程短，一般在1～2 d內(nèi)死亡。剖檢死于禽霍亂的雞，可見肝臟上常有灰黃色壞死點，心包膜內(nèi)有大量的纖維蛋白性滲出液。全身漿膜、黏膜出血，細菌檢查可檢出巴氏桿菌。這些是傳染性喉氣管炎所不具有的。

（五）維生素A缺乏癥病程呈慢性，初期咽和食道沒有纖維蛋白性覆蓋物，而有膿皰樣小結(jié)節(jié)，在上呼吸道的上皮細胞和黏膜腺中可見角化病變，無氣管急性出血性炎癥變化。