蛋白質(zhì)組學(xué)在糖尿病腎病中的研究及應(yīng)用*1

李 娟 亓文波

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 泰安 271000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)常見(jiàn)的并發(fā)癥，是DM全身性微血管病變表現(xiàn)之一，是DM患者的主要死亡原因之一。近年來(lái)DM的患病率呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)，且由于治療方法的改善，生存時(shí)間的增加，從而腎臟及其它并發(fā)癥也增加。目前中國(guó)尿毒癥的第二大原因是DN，而在發(fā)達(dá)國(guó)家及國(guó)內(nèi)的一些發(fā)達(dá)地區(qū)(如上海市)DM已成為腎功能衰竭的主要原因。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的提前完成以及后基因時(shí)代的到來(lái)，有關(guān)基因之間、蛋白質(zhì)之間及基因與蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響、蛋白質(zhì)翻譯后加工和蛋白質(zhì)自身特有活動(dòng)規(guī)律等蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成為科學(xué)界面臨的新的問(wèn)題。其為探討DN發(fā)病機(jī)理、早期診斷方法展現(xiàn)了又一嶄新的前景。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念是由澳大利亞學(xué)者Wihans和Williams等[1]于1994年提出，指的是一個(gè)給定的細(xì)胞、組織、器官或完整的生物體擁有的全部蛋白質(zhì),是一個(gè)基因組內(nèi)所有基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。生物功能的主要體現(xiàn)者是蛋白質(zhì)，而與基因組相比,蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性。蛋自質(zhì)組的種類(lèi)和數(shù)量在同一機(jī)體的不同細(xì)胞中是不相同的，即使是同一細(xì)胞，在不同時(shí)期、不同條件下，其蛋自質(zhì)組也是處于不斷改變之中，因此，它是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念。

隨著蛋白質(zhì)組的提出，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)也就隨之產(chǎn)生。其為一門(mén)以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)為研究基礎(chǔ),在蛋白質(zhì)水平對(duì)疾病機(jī)理、細(xì)胞模式及功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探索的科學(xué)[2]。 現(xiàn)階段蛋自質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容大致可以分為兩大類(lèi)：即結(jié)構(gòu)蛋自質(zhì)組學(xué)和功能蛋自質(zhì)組學(xué)。前者的主要研究方向包括蛋自質(zhì)氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)的解析、種類(lèi)分析及數(shù)量確定。后者則以蛋自質(zhì)的功能和相互作用為主要研究目標(biāo)。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)包括蛋白質(zhì)的分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)和蛋白質(zhì)組信息學(xué)的發(fā)展。蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要包括：雙向凝膠電泳、層析技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、差異凝膠電泳等。其中雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)于1975年提出[3]，至今其在分離蛋白質(zhì)研究中具有不可替代的作用，其原理為：第一項(xiàng)基于蛋自質(zhì)等電點(diǎn)不同在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦(Isoelectric focusing);第二項(xiàng)則根據(jù)分了量大小不同進(jìn)行SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋自質(zhì)混合物中的蛋自質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離后，需要對(duì)單一蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。常用的方法是將感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解后進(jìn)行肽段質(zhì)譜指紋分析即質(zhì)譜分析，與已知蛋白質(zhì)的序列信息進(jìn)行比較和鑒定。目前常用的鑒定技術(shù)有基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)和表面增強(qiáng)激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)等。之后與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息進(jìn)行比對(duì)以獲取、深入分析信息,并指導(dǎo)更深層的功能蛋白質(zhì)學(xué)研究。

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在對(duì)正常腎臟及其腎病研究中的應(yīng)用逐漸增多。其對(duì)了解腎臟的生理功能，腎病的病理機(jī)制及其診斷標(biāo)志物，識(shí)別新的治療靶點(diǎn)有深遠(yuǎn)的意義。

2 正常腎組織及尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀

Sarto等[4]研究了組成人類(lèi)腎臟的蛋白質(zhì)的種類(lèi),發(fā)現(xiàn)單純應(yīng)用2-D凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)至少2 000種不同的蛋白質(zhì),對(duì)其中的47種蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。但該研究中腎臟表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)可能掩蓋了微量蛋白,而且蛋白質(zhì)表達(dá)的具體部位也無(wú)從得知。而腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)具有完全不同的生理功能，因此可以想象它們的蛋白質(zhì)表達(dá)譜必定不同。Arthur等[5]分析比較了大鼠腎臟皮、髓質(zhì)中蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，獲得了1095個(gè)腎皮質(zhì)和885個(gè)腎髓質(zhì)蛋白。其中,成功鑒定的蛋白質(zhì)有72種,有10種在皮質(zhì)大量表達(dá), 6種在髓質(zhì)大量表達(dá)。Witzmann等也進(jìn)行了相似的研究，發(fā)現(xiàn)有127種蛋白質(zhì)在皮、髓質(zhì)中的表達(dá)有明顯差異。由于腎臟結(jié)構(gòu)的多樣性和功能的復(fù)雜性,分別研究腎臟中不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)于了解腎臟生理具有十分重要的意義。Yoshida等[6]試圖構(gòu)建正常人的腎小球蛋白質(zhì)圖譜，從近1600個(gè)可視蛋白點(diǎn)中鑒定了100余個(gè)蛋白質(zhì)。Ransom等[7-8]分析了腎臟足細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)在足細(xì)胞表達(dá)的106種蛋白質(zhì)中,有88種呈特異性表達(dá)。而Hoffert等[9]比較了大鼠髓集合管(MCD)細(xì)胞和非MCD細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)有50種蛋白質(zhì)在IMCD細(xì)胞呈高豐度表達(dá),其中10種在MCD細(xì)胞的表達(dá)量是在非MCD細(xì)胞中的2倍以上。

尿液因其無(wú)創(chuàng)性?xún)?yōu)點(diǎn)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，而正常情況下尿液的蛋白質(zhì)組成反映了腎小球和腎小管的功能。Marshall和W illiams[10]使用染色沉淀方法分離蛋白,成功建立了正常人尿液蛋白的2-D凝膠圖譜,但是未進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。Thongboonkerd等[11]采用丙酮沉淀和超離心方法分離蛋白質(zhì),并利用MALDI- TOF -MS鑒定了其中67種蛋白。Spahr等[12]采用LC-MS/MS技術(shù)從正常人尿液中成功分離了蛋白質(zhì)組份,共獲得124種蛋白和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)翻譯產(chǎn)物。Schaub等[13]應(yīng)用SELDI-TOF- MS分析健康人中段晨尿,發(fā)現(xiàn)女性尿液的肽譜各有不同,而男性之間不存在這種差異。Wittke等[14]還聯(lián)合采用毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)和電噴霧飛行質(zhì)譜(electrospray time-of-flight MS)方法分析了正常人尿液蛋白。雖然這些技術(shù)都具有高通量?jī)?yōu)點(diǎn),但對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步鑒定和定量分析所存在的困難限制了其在臨床中的應(yīng)用。然而尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)仍不失為一種發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物的良好的篩選工具。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在其他腎臟病理研究中的應(yīng)用

蛋白尿是腎臟疾病最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一。Musante等[15]使用兩種不同的層析和電泳技術(shù)，證實(shí)了局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者蛋白尿的產(chǎn)生與循環(huán)中的某種“滲透因子”或‘FSGS因子”損傷了腎小球?yàn)V過(guò)膜有關(guān)[16]的假設(shè)。其實(shí)驗(yàn)確定了10種血漿滲透因子，一步分析鑒定出其中的6種因子，分別是fibulin、載脂蛋白J、玻璃粘蛋白、白蛋白單體、γ-纖維蛋白原及甘露聚糖-結(jié)合植物血凝素-相關(guān)絲氨酸蛋白酶。 最近Gonzalez等[17]又研究了單核細(xì)胞在原發(fā)性腎病綜合征(INS)發(fā)病中的作用。Gonzalez發(fā)現(xiàn)，僅有INS患者的單核細(xì)胞出現(xiàn)L核絲、 а-原肌球蛋白、膜聯(lián)蛋白-Ⅲ上調(diào)，而這些蛋白均參與了細(xì)胞骨架的重排，并使細(xì)胞之間的粘附性增加。

尿毒癥是慢性腎功能不全的終末期。研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥毒素多為30 kD的小分子蛋白，是腎衰竭患者死亡的主要原因。Ward等[18]應(yīng)用2-DE和MALDI-TOF-MS比較了尿毒癥超濾液和正常血漿蛋白表達(dá)的差異，共發(fā)現(xiàn)6種特異性蛋白的21種形式參了尿毒癥毒素的組成，包括微球蛋白、抗胰蛋白酶等。這些研究表明蛋白質(zhì)組學(xué)是探索尿毒癥毒素的一個(gè)有力工具，為更好的研究尿毒癥的病理生理過(guò)程提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)平臺(tái)。

腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)的各種亞學(xué)科中的發(fā)展最為成熟。泌尿系腫瘤,無(wú)論是膀胱癌還是腎細(xì)胞癌,均有了較多的研究成果。Rasmussen等[19]用蛋白質(zhì)組學(xué)方法確定了膀胱磷狀細(xì)胞癌(SCC)患者尿液中出現(xiàn)的124個(gè)多肽。在已鑒定的蛋白質(zhì)中,牛皮癬素只出現(xiàn)于SCC的尿液中,而在移行細(xì)胞癌患者和健康人的尿液中均不出現(xiàn)。因此尿液牛皮癬素(或結(jié)合其它指標(biāo))的檢測(cè)可能成為早期檢測(cè)SCC的生物標(biāo)記物。對(duì)腎細(xì)胞癌(RCC)的研究中，Sarto等[20]發(fā)現(xiàn)RCC患者腎組織中表達(dá)Mn-超氧化物歧化酶的2種寡聚和5種單體形式,而健康人腎臟中只表達(dá)2種單體形式,無(wú)寡聚形式。但是,至今還未證實(shí)哪種指標(biāo)可以作為檢測(cè)RCC的生物標(biāo)記物。

發(fā)現(xiàn)各種腎小球疾病的生物標(biāo)記物是蛋白質(zhì)組學(xué)在腎臟病領(lǐng)域最富成果和最具臨床應(yīng)用價(jià)值的研究。Thongboonkerd等[21]應(yīng)用2-DE比較了幾種不同腎小球疾病(糖尿病腎病、FSGS和Ⅴ型狼瘡性腎炎)患者和健康人的尿液蛋白質(zhì)成分,發(fā)現(xiàn)不同病種的尿蛋白成分區(qū)別很大,共有25種蛋白質(zhì)表達(dá)有明顯差別。與健康人比較,腎炎患者尿液中的白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 а1-抗胰島素的含量較多,而激肽原和phorbolin-3含量相對(duì)較少。僅在FSGS患者尿液中明顯增加的蛋白質(zhì)有豬型生長(zhǎng)激素(第193號(hào))和一種尚未鑒定的蛋白質(zhì)(第230號(hào))。黃艷軍等[22]應(yīng)用2-DE對(duì)腎病綜合征中激素耐藥型和激素敏感型患兒的尿蛋白進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)有明顯差異。對(duì)19個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，鑒定出12個(gè)蛋白質(zhì)。

腎移植術(shù)后患者需要盡量避免反復(fù)的腎活檢。因此,尋找一種損傷較小、能夠經(jīng)常進(jìn)行的檢查方法對(duì)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)做出早期診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Clarke等[23]和Schaub等[24]采用SELDI-TOFMS技術(shù)對(duì)幾組不同患者的尿液蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有幾組蛋白質(zhì)特異地出現(xiàn)于急性排斥反應(yīng)患者的尿液中,很可能作為急性排斥反應(yīng)的診斷標(biāo)記物。但是由于SELDI-TOFMS技術(shù)的局限性,未能分離鑒定這幾種蛋白質(zhì)。Hampel等[25]應(yīng)用凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行了類(lèi)似實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后腎功能穩(wěn)定患者和急性排斥反應(yīng)患者的尿液蛋白質(zhì)模式確有不同。使用ESI-MS和MOLDI-TOFMS技術(shù),進(jìn)一步將β2-微球蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白和碳酸酐酶確定為診斷急性排斥反應(yīng)的候選標(biāo)記物。Tomosugi等[26]用LC-MS/MS分析了急性排斥反應(yīng)患者的血清蛋白質(zhì)組成,認(rèn)為質(zhì)量/電荷單位為11685 m/z的蛋白質(zhì)可以作為急性排斥反應(yīng)診斷的候選指標(biāo)。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在糖尿病腎病中的應(yīng)用

雖然有關(guān)DN的研究取得了很大的進(jìn)展,但其發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制尚未完全清楚,而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為深入研究DN發(fā)病機(jī)制提供了全新的方法。Thougboonkerd等[27]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)120 d的OVE26轉(zhuǎn)基因鼠腎組織蛋白質(zhì)表達(dá)的變化進(jìn)行了研究, OVE26轉(zhuǎn)基因鼠具有人類(lèi)1型糖尿病(T1DM)的特點(diǎn)，這種DM模型是通過(guò)胰島β細(xì)胞鈣調(diào)素的過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生的,且在出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可發(fā)生DM。其他的表現(xiàn)有低胰島素血癥、高脂血癥、蛋白尿和人1型DN早期腎組織病理改變極其相似的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)了30種已知蛋白的差異表達(dá),包括蛋白酶、蛋白酶抑制因子、凋亡相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子、鈣結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞信號(hào)蛋白和平滑肌收縮元件等。這些改變的蛋白中,19種在先前的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)對(duì)DM有調(diào)節(jié)作用,而另11種蛋白的作用尚不清楚。其中兩種蛋白是彈性蛋白酶ⅢB和彈性蛋白酶抑制劑(EIA),彈性蛋白酶ⅢB表達(dá)減少而EIA表達(dá)增加,兩者共同作用的結(jié)果導(dǎo)致彈性蛋白在DM鼠中腎臟的沉積。這些資料首次提出DN涉及腎彈性蛋白和彈性蛋白酶途徑。然而,這種途徑在DN致病中的作用和功能意義尚不清楚。

目前臨床上除微量蛋白尿外,缺乏更特異的DN早期診斷的臨床指標(biāo)。近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，研究者已經(jīng)開(kāi)始利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選能更早、更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)或診斷DN的生物標(biāo)志物，從而真正達(dá)到對(duì)DN的早期診斷和防治。

Kim等[28]采用2-DE和ESI-Q-TOF MS/MS技術(shù)對(duì)單純2型糖尿病(T2DM組)、合并微量蛋白尿(MA組)及合并慢性腎功不全(CRF組)患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究,提出谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( extracellular glutathione peroxidase,eGPx)和載脂蛋白E (apolipoprotein, ApoE)可能作為DN診斷的生物標(biāo)志物,并對(duì)T2DM及合并微量蛋白尿患者血清中eGPx表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

Out等[29]對(duì)Pima印第安T2DM患者進(jìn)行的10年前后的對(duì)照研究證實(shí),可以利用尿蛋白質(zhì)譜預(yù)測(cè)T2DM患者是否發(fā)展為DN。作者選取10年后發(fā)展為DN及未發(fā)展為DN的Pima印第安T2DM患者各31例,兩組患者初始腎功能正常,不合并微量蛋白尿。利用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)兩組患者基線(xiàn)水平及10年后尿蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了714種蛋白質(zhì),其中12種蛋白質(zhì)對(duì)DN的發(fā)生有預(yù)測(cè)作用,準(zhǔn)確性89% (敏感性93%,特異性86% ),而糖化血紅蛋白無(wú)預(yù)測(cè)作用。雖然還需要對(duì)12種特異性蛋白的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究,但該結(jié)果提示尿蛋白質(zhì)譜技術(shù)可用于預(yù)測(cè)T2DM患者是否發(fā)展為DN。

Meier等[30]應(yīng)用CE聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)44例5年以上病程的T1DM患者和正常對(duì)照組的尿蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了1000多種多肽,其中55種僅在T1DM患者尿中存在,另有88種多肽在早期DN患者尿中的表達(dá)與正常對(duì)照有差異。作者認(rèn)為這類(lèi)高通量技術(shù)的應(yīng)用,有利于將來(lái)能更早、更準(zhǔn)確地把DN高危個(gè)體從DM人群中篩選出來(lái)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在DN研究中的廣泛應(yīng)用,將有利于我們更深入、全面了解DN的發(fā)病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)特異性、敏感性高的DN診斷的生物標(biāo)志物。同時(shí)，在不同時(shí)期或治療后，監(jiān)測(cè)腎、尿和血漿蛋白質(zhì)組的系列變化也有助于DN新的靶目標(biāo)的治療，從而真正實(shí)現(xiàn)對(duì)DN的早期、個(gè)體化診斷和治療，最大程度保護(hù)腎功能,減少終末期腎臟病的發(fā)生。

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