秋水仙素在園藝植物多倍體育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙陽(yáng) 黃韜

（遼寧省大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 116036）

采用染色體加倍的方法選育作物新品種的途徑稱為多倍體育種。園藝植物的多倍體育種可以高效率改變園藝植物的某些性狀，如利用無(wú)性繁殖避免因基因重組分離改變品質(zhì)、通過多倍體的巨大性提高產(chǎn)量、對(duì)非種子食用器官的瓜果進(jìn)行三倍體無(wú)籽植株的獲得來(lái)增加商業(yè)價(jià)值等，說明多倍體育種在園藝植物育種中具有重要作用。本文就近年來(lái)有關(guān)秋水仙素對(duì)植物進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了綜合概述。

1 多倍體育種在園藝植物中的應(yīng)用

多倍體是高等植物染色體進(jìn)化的顯著特征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，高等植物中的多倍體占65%以上，如小麥、煙草、棉花、馬鈴薯、甘蔗等都是自然形成的多倍體。在被子植物中約50%是多倍體、豆類植物18%是多倍體。自1937年Blackeslee和Avery利用秋水仙素誘導(dǎo)蔓陀蘿四倍體獲得成功后，已在1000多個(gè)植物種中獲得了人工多倍體。常見的多倍體果樹有三倍體蘋果、多倍體柑橘、三倍體梨、多倍體葡萄、四倍體金絲小棗、多倍體獼猴桃等。三倍體和四倍體的蔬菜有西瓜、白菜、甜瓜、馬鈴薯、茼蒿、黃花菜、辣椒、甘藍(lán)型油菜、黃瓜、番茄、不結(jié)球白菜、花椰菜、芹菜、蘿卜、萵苣、菠菜、絲瓜、石刁柏、生姜、茄子、蘆筍等；花卉中常見的有四倍體金魚草、四倍體麝香百合及多倍體的庫(kù)拉索蘆薈、藥用百合、菊花腦、君子蘭、花葉綠蘿等。

1.1 多倍體育種在果樹上的應(yīng)用

利用多倍體可孕性低來(lái)獲得無(wú)籽或少籽果實(shí)。果樹可以進(jìn)行無(wú)性繁殖，經(jīng)過多倍體誘導(dǎo)后植株產(chǎn)生的多倍體效應(yīng)可以被穩(wěn)定的利用，獲得三倍體無(wú)籽果實(shí)以改良果實(shí)的品質(zhì)。

1.2 多倍體育種在蔬菜上的應(yīng)用

在蔬菜的多倍體育種應(yīng)用上最為著名的是三倍體無(wú)籽西瓜，三倍體西瓜無(wú)籽的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于西瓜育種方面。多倍體的巨大性在蔬菜上也表現(xiàn)顯著，對(duì)以營(yíng)養(yǎng)體為商品部分的蔬菜作物來(lái)說，由細(xì)胞染色體加倍帶來(lái)的性狀變化是有利的。

1.3 多倍體育種在花卉上的應(yīng)用

花器作為花卉的主要觀賞部位，通過多倍體育種的方法可育成1批具有較高觀賞價(jià)值的花卉品種。人工誘導(dǎo)后的花卉品種多具有巨大性、可繁性低、適應(yīng)性強(qiáng)、光合速率高等優(yōu)勢(shì)。

2 秋水仙素加倍法的應(yīng)用

秋水仙素是微管特異性藥物，由于適宜濃度的秋水仙素能破壞紡錘絲的形成，因此可使分生細(xì)胞復(fù)制的染色體在細(xì)胞分裂時(shí)不能分向兩極，從而導(dǎo)致新生細(xì)胞的染色體加倍。

2.1 秋水仙素的處理方法

多倍體除了自然發(fā)生外，也可以通過人工方式誘導(dǎo)。常見的方式是物理和化學(xué)方式。物理方式有溫度激變、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射等。化學(xué)誘導(dǎo)以N-亞硝基-二甲脲和秋水仙素效果最好。

2.1.1 實(shí)體人工加倍處理法 普遍采用的方法有注射法、涂抹法、浸種法及包埋法。在君子蘭、菊花腦、油菜等植株上運(yùn)用浸種法誘導(dǎo)出了多倍體，其缺陷表現(xiàn)在有效誘導(dǎo)效率低、毒害大、缺氧致死等方面；在成齡桑上用注射法誘導(dǎo)成功四倍體植株，其缺陷表現(xiàn)在針頭易刺傷生長(zhǎng)點(diǎn)，造成生長(zhǎng)點(diǎn)腐爛死亡，誘導(dǎo)率低；對(duì)甜菊采用涂抹法誘導(dǎo)多倍體植株，雖可避免機(jī)械損傷，但藥劑與生長(zhǎng)點(diǎn)難以完全接觸；在生姜上使用脫脂棉包埋生長(zhǎng)點(diǎn)法進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)則克服了以上許多問題。

2.1.2 離體培養(yǎng)加倍法 隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，染色體加倍可以在離體組織培養(yǎng)條件下利用秋水仙素誘導(dǎo)單個(gè)體細(xì)胞染色體加倍，獲得多倍體再生。這一方法可以克服常規(guī)人工加倍處理方法的缺陷，容易控制實(shí)驗(yàn)條件，減少或避免倍性嵌合體。離體材料一般是愈傷組織、莖尖、莖段、根尖組織、胚狀體或用子房、原生質(zhì)體。離體條件下染色體加倍的途徑有：（1）先用秋水仙素溶液處理培養(yǎng)材料，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；（2）在含秋水仙素的離體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間，誘導(dǎo)加倍，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。陳新民等使用胚培養(yǎng)后加倍和浸根加倍處理兩種方法都獲得了較明顯的加倍效果。利用組織培養(yǎng)的方法我國(guó)已獲得了蘋果、葡萄、蘆筍、百合、大蒜、西瓜等園藝植物的多倍體材料。

2.2 秋水仙素的濃度和處理時(shí)間

秋水仙素的濃度和處理時(shí)間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙素水溶液處理外植體時(shí)，關(guān)于濃度和處理時(shí)間的最適宜組合問題尚有不同看法。染色體加倍的原理是化學(xué)藥物能夠破壞、阻止紡錘絲的形成。沒有紡錘絲參與，染色體復(fù)制和分裂雖然正常，但分裂開來(lái)的單體卻因分裂而加了倍。由于這種加倍原理，導(dǎo)致了不同植物在不同濃度及處理時(shí)間產(chǎn)生的效果不同，有些學(xué)者認(rèn)為低濃度長(zhǎng)時(shí)間的組合較好，但還有些學(xué)者則傾向于高濃度短時(shí)間的組合。由于不同來(lái)源的外植體對(duì)秋水仙素的反應(yīng)、耐受能力及敏感程度不同導(dǎo)致不同作物有其適當(dāng)?shù)慕M合性。在對(duì)蒔菜加倍時(shí)，適宜的秋水仙素濃度為100mg/L，處理時(shí)間為10～14d；生姜的染色體加倍適宜濃度為30mg/L，處理時(shí)間5d；小麥產(chǎn)生小麥單倍體的染色體加倍適宜濃度為500mg/L，處理時(shí)間為24h；菊花腦染色體加倍適宜濃度為50mg/L，處理時(shí)間為48h；葡萄染色體加倍適宜濃度0.4%～0.6%，處理時(shí)間48～72h；葡萄二倍體玫瑰香品種進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)的適宜濃度為0.2%，處理時(shí)間45h；嘎拉蘋果的染色體加倍適宜濃度為0.5%，處理時(shí)間為96h；藍(lán)莓的染色體加倍適宜濃度為0.025%，處理時(shí)間24～48h；甜椒花藥染色體加倍適宜濃度為0.1%～0.2%；草莓莖尖染色體加倍的適宜濃度為200～400mg/L，處理時(shí)間為 20～30d；馬鈴薯染色體加倍適宜濃度為0.2%～0.3%，處理時(shí)間 12～48h；西瓜染色體加倍適宜濃度0.05%；黃花菜的染色體加倍，用0.05%濃度的棉花對(duì)帶芽狀突起的球狀體進(jìn)行覆蓋，并將其轉(zhuǎn)移到0.02%～0.05%的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)效果最佳；獼猴桃染色體加倍的適宜濃度為200mg/L，處理時(shí)間為7d；小葉綠蘿同源多倍體誘導(dǎo)適宜濃度為0.05%，處理時(shí)間3d；苧麻多倍體育種適宜濃度0.1%～0.25%,處理時(shí)間12～24h；堅(jiān)尼草的染色體加倍適宜濃度為0.1%，對(duì)種子的處理時(shí)間為4h；皇家嘎拉蘋果多倍體誘導(dǎo)的適宜濃度為25mg/L，處理時(shí)間為5d；蘆筍的多倍體誘導(dǎo)適宜濃度為0.1%，處理時(shí)間為12h；菠菜種子染色體加倍濃度為0.4%，處理時(shí)間為12h；黃瓜干種子多倍體誘導(dǎo)的適宜濃度為0.35%，處理時(shí)間為48h；辣椒幼苗滴心處理進(jìn)行染色體加倍適宜濃度為0.2%，處理時(shí)間7d；茼蒿染色體加倍時(shí)滴苗處理適宜濃度為0.1%～0.2%，處理時(shí)間為48h；藥用百合叢生芽進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)的適宜濃度為0.1%，處理時(shí)間72h；庫(kù)拉索蘆薈對(duì)試管苗的多倍體誘導(dǎo)適宜濃度為0.06%，處理時(shí)間12h，對(duì)莖段、葉片進(jìn)行覆棉處理的適宜0.02%，處理時(shí)間48h。

秋水仙素處理的濃度和時(shí)間因處理對(duì)象的不同而異，材料質(zhì)密溶液滲透慢時(shí)，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)處理時(shí)間。據(jù)報(bào)道秋水仙素濃度在0.01%～1.0%內(nèi)都是有效的，最常用的濃度為0.2%，在對(duì)某一植物作初次誘導(dǎo)試驗(yàn)時(shí)，一般采用高濃度短時(shí)間的處理方法。對(duì)于園藝植物來(lái)說，果樹和觀賞樹木多用較高濃度（1.0%～1.5%）,而草本的蔬菜和花卉則應(yīng)用較低濃度（0.01%～0.2%）。

3 多倍體的鑒定方法

經(jīng)過秋水仙素處理以后，有些材料的染色體加倍，有些未發(fā)生加倍，還有些為嵌合體。而因其加倍效果的鑒定是倍性操作的重要一步。目前的鑒定方法主要有以下幾種。

3.1 形態(tài)鑒定法

植物體細(xì)胞染色體加倍后，分化生成多倍體植株，一般表現(xiàn)為巨大性。通常莖變粗短，葉片變厚，有時(shí)比較粗糙或生皺紋，多毛，花朵、果實(shí)和種子變大，生育期延長(zhǎng)，整個(gè)植株變成巨型，這些特征都可作為判別多倍體的依據(jù)。

3.2 氣孔鑒定法

根據(jù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目、單位面積的氣孔數(shù)目、氣孔的長(zhǎng)度和寬度鑒定多倍體。應(yīng)以葉綠體數(shù)目和氣孔密度為主，用氣孔大小作為參考。

3.3 花粉粒鑒定法

根據(jù)花粉粒的大小及不同花粉數(shù)目可鑒定倍性，一般四倍體的花粉比二倍體大1倍；通過觀察比較再生植株花蕾與花的大小、花粉形成與結(jié)角等形態(tài)特征可鑒別二倍體與單倍體。

3.4 染色體數(shù)目鑒定法

盡管早期可以通過上述3種方法初步鑒別出多倍體，但要斷定為多倍體還要進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，多采用植物組織培養(yǎng)物的染色體制片技術(shù)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，該法是到目前為止最為直觀準(zhǔn)確的鑒定方法?，F(xiàn)在已有報(bào)道，通過細(xì)胞光度儀來(lái)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的DNA含量，然后根據(jù)DNA含量比較來(lái)推斷細(xì)胞的倍性水平。如Owen通過流式細(xì)胞儀分析馬鈴薯單元單倍體和多倍體DNA含量，Nokamura用普通光學(xué)顯微鏡分析四倍體葉面與二倍體葉面的相對(duì)含量；Wan對(duì)玉米的誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行鑒定分析。

4 前景展望

在今后的植物多倍體誘導(dǎo)育種中，尤其是當(dāng)某一親本具有不利的細(xì)胞質(zhì)基因時(shí)，利用該法通過調(diào)整親本的倍性，對(duì)克服遠(yuǎn)緣雜交不孕性、遠(yuǎn)緣雜交的不實(shí)性、創(chuàng)造遠(yuǎn)緣雜交育種的中間親本及培育作物新品種等方面仍有積極的作用。因多倍體的產(chǎn)生受外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)、倍性水平以及秋水仙素的處理時(shí)間、濃度、溫度和滲透劑的影響。要使秋水仙素誘導(dǎo)多倍體成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，還需在更多植物上開展廣泛的研究。尤其是外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)加倍效果的影響機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。